擴(kuò)增子測(cè)序：成功建立擴(kuò)增子測(cè)序5種技巧

  擴(kuò)增子測(cè)序是一種目標(biāo)基因測(cè)序方法，它針對(duì)特定基因組區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。什么是擴(kuò)增子測(cè)序？它有什么用途？上海通蔚生物在下文詳細(xì)為大家介紹，使大家了解更多生物知識(shí)應(yīng)用于科研。

  什么是擴(kuò)增子測(cè)序？

  擴(kuò)增子測(cè)序是一種靶向測(cè)序方法，使用寡核苷酸引物擴(kuò)增基因組的特定區(qū)域。這種方法為研究人員提供了機(jī)會(huì)，使他們能夠僅獲取他們最關(guān)心的基因組代碼部分的遺傳信息。擴(kuò)增子測(cè)序采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，這是分子生物學(xué)中最廣泛使用的技術(shù)之一。PCR包括在短時(shí)間內(nèi)創(chuàng)建特定核酸樣本的多個(gè)副本（這一過程稱為擴(kuò)增）。

  擴(kuò)增子測(cè)序是研究復(fù)雜自然和人工環(huán)境中的微生物多樣性、靶向病原體測(cè)序以追蹤傳播途徑和研究病原體進(jìn)化以及變異識(shí)別的完美工具。

  擴(kuò)增子測(cè)序有何用途？

  擴(kuò)增子測(cè)序廣泛用于識(shí)別各種病原體并追蹤其進(jìn)化和傳播模式。該技術(shù)在COVID-19大流行期間對(duì)追蹤和控制SARSCoV-2病毒的傳播做出了重大貢獻(xiàn)。擴(kuò)增子還廣泛應(yīng)用于各種分子生物學(xué)技術(shù)中，如DNA測(cè)序、基因組學(xué)、環(huán)境微生物學(xué)等。通過擴(kuò)增特定的DNA序列，可以快速而精確地檢測(cè)和鑒定目標(biāo)生物體或基因，從而在研究和診斷中起到重要的作用。

  什么是16SrRNA測(cè)序？

  16SrRNA測(cè)序是最流行的擴(kuò)增子測(cè)序方法之一。它通常用于識(shí)別和比較給定樣本中細(xì)菌和古細(xì)菌的分類組成。這種強(qiáng)大且經(jīng)濟(jì)高效的非培養(yǎng)方法使科學(xué)家有機(jī)會(huì)識(shí)別使用更傳統(tǒng)的濕式實(shí)驗(yàn)室技術(shù)時(shí)可能會(huì)被忽視的菌株。原核生物16SrRNA基因長(zhǎng)約1500bp，包含9個(gè)可變區(qū)(V1-V2)，這些可變區(qū)由保守區(qū)隔開。對(duì)16SrRNA基因的這些可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序被廣泛用于復(fù)雜微生物群落的深度分類（在屬或有時(shí)甚至在物種級(jí)別）。此外，16SrRNA測(cè)序受益于擴(kuò)增子測(cè)序的固有優(yōu)勢(shì)，包括能夠在一次測(cè)序運(yùn)行中組合多個(gè)樣本（多重）。

  成功建立擴(kuò)增子測(cè)序?qū)嶒?yàn)的五個(gè)技巧：

  1.核酸樣本

  使用新鮮、高質(zhì)量的核酸模板。鑒于基于PCR的方法（包括擴(kuò)增子測(cè)序）的分辨率非常高（這通常被認(rèn)為是一種優(yōu)勢(shì)），使用降解或受污染的模板可能會(huì)導(dǎo)致不確定或有爭(zhēng)議的結(jié)果。

  2.主混合物和高標(biāo)準(zhǔn)引物設(shè)計(jì)

  使用市售的主混合物，而不要單獨(dú)混合所有成分[DNA聚合酶、核苷酸(dNTP)、特定離子(MgCl2)]。這有助于最大限度地減少人為錯(cuò)誤以及樣本間差異，并提高一致性。

  3.污染

  擴(kuò)增子測(cè)序的高分辨率意味著即使輸入模板量非常小，也會(huì)導(dǎo)致分析樣本中不存在的污染序列的擴(kuò)增。這就是為什么PCR區(qū)域的所有表面都應(yīng)定期用5%漂白劑溶液或紫外線消毒進(jìn)行消毒。如果可能的話，請(qǐng)?jiān)跓o(wú)模板區(qū)域（最好是單獨(dú)的房間）準(zhǔn)備PCR反應(yīng)，然后在另一個(gè)房間添加核酸樣本。

  4.控制

  最大限度地減少污染可能性的最有效方法之一是在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中有效使用控制。

  a、陰性或無(wú)模板對(duì)照(NTC)對(duì)于確認(rèn)沒有交叉污染尤為重要。NTC包括除核酸模板之外的所有試劑；通常用等量的無(wú)核酸酶水代替模板。

  b、陽(yáng)性對(duì)照包含已知核酸序列和用于檢測(cè)該序列的引物。該對(duì)照用于識(shí)別假陰性結(jié)果。如果陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)生信號(hào)，則表示PCR中的所有試劑均正常工作。陽(yáng)性對(duì)照對(duì)于研究條形碼錯(cuò)配的影響特別有用。

  5.條形碼不匹配

  由于現(xiàn)代NGS平臺(tái)會(huì)生成大量數(shù)據(jù)，因此通常會(huì)將多個(gè)文庫(kù)合并（或多路復(fù)用）并在一次運(yùn)行中進(jìn)行測(cè)序，以降低測(cè)序成本。為了能夠在測(cè)序后識(shí)別每個(gè)讀取，在文庫(kù)制備步驟中，使用樣本特定的DNA索引標(biāo)記所有DNA片段（或進(jìn)行條形碼編碼）。這種樣本多路復(fù)用有時(shí)會(huì)導(dǎo)致索引錯(cuò)誤分配，原因是各種機(jī)制，包括索引跳躍或條形碼污染。因此，測(cè)序讀取可能會(huì)分配給錯(cuò)誤的索引（從而分配給錯(cuò)誤的樣本），并將從下游生物信息學(xué)分析中丟棄。為了最大限度地降低條形碼錯(cuò)誤分配的風(fēng)險(xiǎn)，建議仔細(xì)選擇多路復(fù)用策略，以使用獨(dú)特的雙索引(UDI)適配器或索引引物。

  擴(kuò)增子測(cè)序是一種高通量靶向測(cè)序方法，使研究人員有機(jī)會(huì)在一次運(yùn)行中對(duì)多達(dá)數(shù)千個(gè)感興趣的基因區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。與非靶向方法相比，這種高度針對(duì)性的方法具有成本效益，并且周轉(zhuǎn)時(shí)間更短。