elisa實(shí)驗(yàn)：認(rèn)識(shí)比色測(cè)定、發(fā)光和熒光的方法

  ELISA最初是為了取代放射免疫測(cè)定(RIA)中常用的放射性碘標(biāo)簽而開(kāi)發(fā)的。它們通常包含96孔板形式，孔上結(jié)合有抗原（直接和間接ELISA）或抗體（夾心和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA）。通過(guò)一系列封閉清洗和檢測(cè)步驟，測(cè)量待測(cè)生物樣品中分析物的濃度，通常與已知抗原濃度的系列或標(biāo)準(zhǔn)稀釋曲線進(jìn)行比較。關(guān)于elisa方法，可以參考：《ELISA是什么檢測(cè)方法？帶您深入了解ELISA》

  ELISA中常用三種不同的檢測(cè)系統(tǒng)：比色測(cè)定、發(fā)光和熒光。這些都依賴于一種顯示反應(yīng)介質(zhì)中可量化變化的方法，通常是顯色，這取決于分析物的濃度。在ELISA過(guò)程結(jié)束時(shí)，添加與酶聯(lián)報(bào)告基因發(fā)生反應(yīng)的酶底物試劑，從而發(fā)生顏色變化。

  與抗體結(jié)合的最常見(jiàn)報(bào)告基因是辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)和β-D-半乳糖苷酶(BG)。這三種物質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下都很穩(wěn)定、呈惰性，并且相對(duì)易于使用。

  HRP是一種小分子，因此，當(dāng)它與測(cè)定抗體結(jié)合時(shí)，不會(huì)引起空間位阻并干擾抗原結(jié)合。然而，它會(huì)受到某些常見(jiàn)防腐劑（例如疊氮化鈉）的影響，并且還可能受到生物樣品中內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性的影響。確保ELISA期間進(jìn)行充分的洗滌步驟通常可以減輕干擾。

  AP是較大的分子，因此必須注意避免空間位阻。檢測(cè)還需要更嚴(yán)格的條件，因此應(yīng)使用AP特異性檢測(cè)緩沖液。

  BG是一種更大的分子，但更適合疏水性膜表面（例如斑點(diǎn)印跡），因?yàn)橛米鳚?rùn)濕劑的酒精可以增強(qiáng)檢測(cè)。

  ELISA檢測(cè)方法

  ELISA測(cè)定通過(guò)測(cè)量報(bào)告分子對(duì)作為測(cè)定最后步驟添加的酶底物的作用來(lái)讀取。底物的選擇取決于測(cè)定形式。例如，不溶性的最終結(jié)果最適合膜結(jié)合反應(yīng)，例如斑點(diǎn)印跡。

  其他考慮因素包括預(yù)期濃度范圍、測(cè)定時(shí)間、靈敏度和使用的檢測(cè)裝置。例如，在預(yù)期濃度范圍較廣的情況下，使用反應(yīng)超過(guò)15至30分鐘的酶底物可能會(huì)產(chǎn)生最佳結(jié)果。分析物濃度極低的靈敏測(cè)定需要快速作用的底物。具有定時(shí)終點(diǎn)的測(cè)定包括在讀數(shù)之前停止并穩(wěn)定反應(yīng)的終止步驟。還可以通過(guò)在一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多次測(cè)量來(lái)監(jiān)控轉(zhuǎn)化率，以顯示動(dòng)力學(xué)分析。

  比色測(cè)定檢測(cè)顯示可以在可見(jiàn)光譜中定量的顏色變化，其中光密度隨濃度變化。在讀取平板之前，持續(xù)孵育以使所有孔均等發(fā)育非常重要。

  熒光免疫測(cè)定使用在某些光波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)發(fā)出熒光的酶底物。它們通常與比色測(cè)定一樣靈敏，但不受較高分析物濃度的限制。它們可以發(fā)出更強(qiáng)烈的光，而不會(huì)產(chǎn)生壓倒性的信號(hào)檢測(cè)，從而提供準(zhǔn)確的讀數(shù)。

  ELISA中的發(fā)光檢測(cè)依賴于生物發(fā)光（其中光由生物底物產(chǎn)生）或化學(xué)發(fā)光（其中化學(xué)反應(yīng)后釋放光子）。由于發(fā)光技術(shù)與信號(hào)倍增和放大的兼容性，因此被認(rèn)為是ELISA檢測(cè)最靈敏的方法。

  上述內(nèi)容為大家介紹ELISA檢測(cè)方法，大家可以根據(jù)自身的實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)照自己需要的檢測(cè)方法，從而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的讀數(shù)。