免疫檢測實驗：標記物類型介紹

  抗體標記，或?qū)⑻囟擞浉街娇贵w上以幫助檢測或分離/純化蛋白質(zhì)，是一項重要的技術。標記抗體對于蛋白質(zhì)印跡、ELISA、流式細胞術、免疫組織化學(IHC)和免疫熒光(IF)等基于免疫的測定至關重要。標記抗體還用于從復雜的蛋白質(zhì)混合物中分離和純化單一蛋白質(zhì)。與其他蛋白質(zhì)一樣，抗體可以用小分子、放射性同位素、酶蛋白和熒光染料標記。

  傳統(tǒng)上，通常采用兩種不同的化學方法來標記與小分子共價的抗體：

  1.該標記與伯胺發(fā)生反應，用于標記抗體分子中的賴氨酸殘基

  2.抗體鏈內(nèi)的二硫鍵被還原，然后與硫醇反應性標記發(fā)生反應

  目前，已經(jīng)開發(fā)出更新的方法，包括將標記非共價添加到抗體的Fc部分，或?qū)擞浌矁r添加到抗體重鏈的N連接聚糖上。使用的標記物類型取決于下游應用。終點將關注抗體的非放射性標記及其用途。下文總結(jié)了不同免疫測定中使用的標記類型。

  生物素標記

  生物素是一種小分子，其結(jié)合親和素（存在于蛋清中）和鏈霉親和素（由鏈霉菌鏈霉菌產(chǎn)生）形成自然界中最強的非共價相互作用之一。由于其大小，生物素很少破壞抗體的活性，使其成為標記物的不錯選擇。

  生物素標記抗體用于蛋白質(zhì)印跡、ELISA、流式細胞術、免疫熒光和免疫組織化學，當抗原難以檢測時，通常采用生物素標記抗體來提高測定的靈敏度。通常，印跡或樣品與生物素標記的抗體一起孵育，然后與用酶或熒光染料標記的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白進行第二次孵育。抗體通常與多個生物素分子（3-6個分子）綴合，從而產(chǎn)生擴增步驟，從而增強對豐度較低的抗原的檢測。雖然生物素標記物可以改善檢測，但它可能難以用于蛋白質(zhì)的分離/純化，因為生物素和（鏈霉）親和素之間的強相互作用可能難以破壞。

  許多公司銷售生物素化試劑盒，其中含有反應性生物素分子，可輕松標記蛋白質(zhì)。通常，通過使用生物素類似物的N-羥基琥珀酰亞胺酯將抗體標記在賴氨酸的ε-氨基上。生物素使用至少6個原子的間隔臂附著在蛋白質(zhì)上，以防止下游操作過程中的空間障礙。間隔臂的長度和成分可以不同，以優(yōu)化測定。

  酶標記

  傳統(tǒng)上，Western、ELISA和IHC最常用的抗體標記是酶標記。酶標記比生物素大，但它們很少破壞抗體功能。最常用的酶標記是辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶。

  要使用酶標記抗體，將樣品與酶特異性底物一起孵育，酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物（顯色測定）或光（化學發(fā)光測定）。每種酶都有一組可用的底物和檢測方法。例如，HRP可以與二氨基聯(lián)苯胺反應產(chǎn)生棕色產(chǎn)物，或與魯米諾反應產(chǎn)生光。相比之下，AP可以與對硝基苯磷酸酯（pNPP）反應生成黃色產(chǎn)物（通過分光光度計檢測）或與5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）和硝基藍四唑（NBT）反應生成黃色產(chǎn)物紫色沉淀。顯色測定可用于蛋白質(zhì)印跡、ELISA和IHC，而生光反應最常用于蛋白質(zhì)印跡。許多具有不同靈敏度和輸出的底物可用于檢測，使酶報告基因成為最流行的抗體標記之一。

  盡管報道酶也與賴氨酸的ε-氨基綴合，但由于酶含有賴氨酸并且具有多聚化的潛力，因此可以采用額外的化學方法。酶標記二抗可通過多家公司廣泛獲得，而其他公司則銷售用于在實驗室中標記抗體的試劑盒。

  熒光標記

  實驗室中熒光標記抗體的使用正在穩(wěn)步增加。由于熒光染料直接與抗體綴合，因此檢測不需要酶/底物或結(jié)合相互作用。因此，檢測到的熒光信號量與樣品中目標蛋白的量成正比。熒光標記用于熒光Western測定、流式細胞術和IF，可用于高度定量測定。

  為了檢測熒光標記，需要一種儀器來發(fā)射激發(fā)熒光染料的指定波長的光。然后熒光染料發(fā)出不同波長的信號。同一儀器包含適當?shù)倪^濾器，用于檢測熒光染料的發(fā)射。流式細胞術需要使用流式細胞儀，而IF則使用熒光顯微鏡。數(shù)字成像系統(tǒng)通常用于蛋白質(zhì)印跡。抗體可以用具有不同激發(fā)和發(fā)射光譜的多種熒光染料標記。除了高度定量之外，熒光標記還具有獨特的優(yōu)勢，即通過使用具有不重疊發(fā)射光譜的染料，能夠同時檢測兩種或多種不同的目標蛋白。

  對于標記，熒光標記物可以通過伯胺或硫醇基團共價連接到抗體上。熒光標記的抗體可以從許多公司購買，或者可以使用商業(yè)試劑盒在實驗室中標記抗體。