優(yōu)化ELISA試劑盒：提高靈敏度的關鍵要素

  內(nèi)容列表：

  ELISA 簡介

  ELISA試劑盒中匹配的抗體對

  酶聯(lián)免疫吸附測定樣品

  ELISA 封閉和洗滌步驟

  如何提高ELISA靈敏度

  ELISA 簡介

  酶聯(lián)免疫吸附測定 ( ELISA ) 是現(xiàn)有的最靈敏和可重復性最高的技術之一。這些測定快速、易于執(zhí)行且易于自動化。與任何檢測一樣，ELISA 的重現(xiàn)性和可靠性取決于正確的技術和對細節(jié)的關注。

  ELISA技術分為：

  直接 ELISA，其中抗原固定在 ELISA 板上，一抗帶有標記（圖 1 A）

  間接 ELISA，其中抗原固定在 ELISA 板上，二抗帶有標記（圖 1 B）

  三明治 ELISA，其中兩個一抗（用于捕獲和檢測）嵌入抗原，形成“三明治”，然后復合物被二抗標記抗體識別（圖 1 C）。

  圖 1. ELISA 格式的類型：A) 直接、B) 間接和 C) 夾心 ELISA。

  ELISA 試劑盒中匹配的抗體對

  匹配對是指已知可識別同一蛋白質抗原上不同表位的抗體組，因此它們可以一起用于夾心 ELISA 中捕獲和檢測單個抗原。ELISA 測定中使用的抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體或兩者的組合。

  單克隆抗體可用于所有類型 ELISA 中所有含抗體的步驟。它們通常在夾心 ELISA 中成組使用，但也可與多克隆抗體結合用于捕獲或檢測，以增強信號或提供更大的從復雜溶液中捕獲抗原的機會。

  由于多克隆抗體溶液中抗體的異質性和表位的廣泛代表性，多克隆抗體可以成為檢測抗原的強大工具，通常比單克隆抗體產(chǎn)生更高的信號水平。然而，多克隆抗體更有可能與密切相關的蛋白質共享一個或多個表位，從而導致更高的非特異性信號。減少該問題的一種方法是使用親和純化或交叉吸收的多克隆抗體。為了提高測定靈敏度，可以將 ELISA 的檢測方法從直接檢測轉換為使用多克隆抗體的間接檢測。

  酶聯(lián)免疫吸附測定樣品

  ELISA 可以測試多種樣品，測定條件的選擇將取決于樣品的復雜性和預期存在的抗原量。

  重要的是要結合已知標準對所有樣品進行一式兩份或三次測試，以確保結果和定量的準確性。

  最好測試樣品的幾種稀釋度，以確保最終結果落在標準曲線的線性部分內(nèi)。高度濃縮的樣品可能會低估濃度，而高度稀釋的樣品可能會高估濃度。

  ELISA 封閉和洗滌步驟

  通常需要進行封閉，以防止檢測抗體與多孔板表面本身的非特異性結合。當板完全封閉時，由于非特異性信號將減少，因此測定靈敏度將增強。

  徹底的清洗程序對于獲得可靠的 ELISA 結果至關重要。重要的是通過輕輕地將吸液頭放入底部來完全吸出所有孔中的液體。避免劃傷孔的內(nèi)部。清洗完成后，建議將板倒置并在吸水紙上擦干。

  如何提搞elisa試劑盒靈敏度

  捕獲抗體濃度

  在包被緩沖液中制備不同濃度的捕獲抗體。

  阻塞緩沖區(qū)

  準備不同的封閉液。如果封閉液未預先配制（即，它是單一蛋白質，例如 BSA），請嘗試不同濃度的蛋白質。

  標準稀釋液

  盡量使標準稀釋劑與樣品基質盡可能匹配。

  如果基質本身不能精確復制，則測試不同的標準稀釋溶液并檢查樣品的標準曲線和稀釋線性。可能需要選擇不同的稀釋劑。

  如果樣品的線性度較差，則樣品基質和標準稀釋劑之間可能存在不平衡。在這種情況下，應進行加標回收或稀釋線性實驗。

  樣品濃度

  準備不同濃度的樣品，同時牢記底物的檢測限。為了確認生物樣品基質不會掩蓋或增強信號，應進行加標和回收以及稀釋線性實驗。

  檢測抗體濃度

  制備不同濃度的檢測抗體。

  酶結合物濃度

  根據(jù)底物描述的 ELISA 試劑盒范圍制備不同濃度的酶綴合物。

  信號檢測

1.   根據(jù)樣品中抗原的量以及用讀板器檢測抗原的能力來選擇底物。
2.   如果可以清楚地檢測到抗原，則底物是合適的。
3.   如果抗原低于檢測閾值，則選擇更靈敏的底物。