elisa實驗原理全解析：酶聯(lián)免疫吸附試驗的工作原理及其重要性

  酶聯(lián)免疫吸附測定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 簡稱。是免疫學檢測應(yīng)用比較廣的技術(shù)。ELISA具有更高的靈敏度和專一性，可以檢測非常低濃度的生物分子，如蛋白質(zhì)、抗體和細胞因子等，并可區(qū)分相似的分子。這使得ELISA 在診斷疾病、監(jiān)測病情、檢測病原體等方面更加具有可信度和精確度。下面通蔚生物給大家詳細介紹下ELISA實驗原理。

  

  ELISA實驗原理

  

  Elisa為免疫學反應(yīng)為基礎(chǔ)，在ELISA技術(shù)中，將抗原固定在固相表面上，然后與抗體結(jié)合形成抗原抗體鍵復(fù)合物，其中抗原抗體復(fù)合物與酶結(jié)合。由于酶與底物之間的反應(yīng)，會形成顏色變化形式的檢測信號。在ELISA實驗應(yīng)用中，具體方法有很多種，比如常見的用于檢測抗體包括直接法、間接法、競爭法和夾心法等。

  

  ELISA操作步驟

  

  有幾種不同的 ELISA 測定技術(shù)，但它們都利用在 96 孔聚苯乙烯板固相載體。這些孔經(jīng)過化學處理，使其具有“粘性”，從而增加了蛋白質(zhì)吸附到板表面的能力。

  

  ELISA 測定依賴于酶結(jié)合標記和底物之間的酶促反應(yīng)來產(chǎn)生比色、化學發(fā)光或熒光產(chǎn)物。然后通過分光光度計或熒光計檢測和定量這些產(chǎn)物，提供有關(guān)樣品中目標蛋白濃度的信息。

  

  ELISA 由多個步驟組成。其中許多步驟是封閉和洗滌步驟，以防止非特異性結(jié)合。當?shù)鞍踪|(zhì)通過脫靶相互作用相互吸附或吸附到 ELISA 板的固相表面時，就會發(fā)生非特異性結(jié)合。不同方法之間的確切 ELISA 步驟略有不同，但這里我們將重點關(guān)注夾心 ELISA作為示例。

  

  夾心ELISA（酶聯(lián)免疫吸附分析），該實驗基本原理是抗體-抗原之間的特異性結(jié)合反應(yīng)，通過夾心模式將抗體固定在酶標板孔中，再加入樣本和酶標二抗，最后通過底物顯色反應(yīng)讀取光密度值，從而計算出抗原或抗體的濃度。

  

  實驗器材：酶標板、抗體、樣本、酶標二抗、底物等

  

  實驗步驟步驟：本實驗步驟分為九個步驟

  

  夾心 ELISA 步驟：

  

  第 1 步：捕獲蛋白的固定化

  

  在夾心 ELISA 中，捕獲蛋白是抗體，目標是抗原。因此，ELISA 的第一個步驟是將捕獲抗體固定到板上。許多 ELISA 試劑盒都帶有預(yù)先固定的捕獲蛋白。

  

  第 2 步：洗掉孔表面任何未吸附的捕獲蛋白

  

  使用去污劑的洗滌步驟可減少蛋白質(zhì)之間的脫靶疏水相互作用，并從板上去除未結(jié)合的捕獲蛋白質(zhì)。

  

  第 3 步：封閉板上任何未結(jié)合的位點

  

  蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用是由電荷或疏水性介導(dǎo)的。這意味著可以通過封閉和清洗步驟在一定程度上減輕它們。

  

  將蛋白質(zhì)添加到板中，蛋白質(zhì)吸附到板表面的開放位點。牛血清白蛋白 (BSA)、酪蛋白或抑肽酶等蛋白質(zhì)通常用于 ELISA 測定中的封閉。

  

  這些蛋白質(zhì)將吸附到板上，從而防止目標蛋白質(zhì)隨后訪問這些位點。以這種方式降低非特異性結(jié)合的發(fā)生率會導(dǎo)致背景噪音降低。

  

  第 4 步：洗掉孔中所有未吸附的封閉蛋白

  

  第二個洗滌步驟去除任何未結(jié)合的封閉蛋白。

  

  第 5 步：與樣品（血清、尿液、唾液或加標研究溶液）一起孵育

  

  在這一步中，抗體和抗原之間發(fā)生特異性識別。在夾心 ELISA 中，抗體被吸附到板上，并與樣品液中的目標抗原結(jié)合。這需要一個孵育步驟以使結(jié)合動力學達到平衡。

  

  第6步：洗掉孵化液

  

  這是至關(guān)重要的洗滌步驟，通常需要多次洗滌以確保洗掉任何未結(jié)合的抗原。在此步驟之后，孔中唯一應(yīng)保留的抗原是那些附著于捕獲抗體的抗原。

  

  第7步：與檢測抗體一起孵育

  

  ELISA 中的檢測抗體與某種標記物結(jié)合，例如熒光團（用于熒光測定）或酶（用于比色檢測或化學發(fā)光）。檢測抗體“識別”目標抗原上與捕獲抗體不同的表位。因此，三明治 ELISA 測定產(chǎn)生捕獲抗體-抗原-檢測抗體的“三明治”。

  

  第8步：洗掉未結(jié)合的檢測抗體

  

  步驟9：應(yīng)用底物進行化學比色或化學發(fā)光反應(yīng)，或應(yīng)用入射光進行熒光反應(yīng)，并對信號進行定量

  

  根據(jù)所使用的 ELISA 方法，熒光量、發(fā)光量或顏色強度表明從樣品中捕獲了多少目標抗原。

  

  Elisa實驗應(yīng)用

  

  ELISA 測試有多種應(yīng)用，例如食品工業(yè)、疫苗開發(fā)、免疫學、診斷、藥物監(jiān)測、制藥工業(yè)和移植。

  

   食品工業(yè)

  

  ELISA 在食品工業(yè)中發(fā)揮著重要作用。它是識別食物過敏原（例如牛奶、花生、核桃、杏仁和雞蛋中的過敏原）的主要平臺。ELISA 還可用于證實食品的真實性。該技術(shù)對于避免冒充替代可能造成的經(jīng)濟損失有很大幫助。

  

  疫苗開發(fā)

  

   疫苗開發(fā)是 ELISA 的一個非常重要的應(yīng)用，它是 ELISA 過程的一個很好的候選者?？梢詼y試來自免疫動物或人類模型的血清樣本，以檢測是否存在針對有意注射到宿主體內(nèi)的某些類型抗原的抗體。

  

  免疫學

  

  身體的防御者，免疫系統(tǒng)，可以以細胞或體液（先天或適應(yīng)性）模式運作。測量和監(jiān)測免疫反應(yīng)的變化是了解免疫疾病的基礎(chǔ)。各種研究已證明 ELISA 是此類測量和監(jiān)測的金標準方法，該方法快速且經(jīng)濟高效。

  

  體液免疫

  

  ELISA 在研究免疫系統(tǒng)對不同類別感染的體液反應(yīng)方面也顯示出巨大的潛力。體液免疫反應(yīng)涉及體液中存在的物質(zhì)（抗體和其他成分）。

  

  診斷

  

  在診斷領(lǐng)域，ELISA 已被證明是一個在全球范圍內(nèi)應(yīng)用的強大平臺，可用于檢測人類和動物的多種疾病類型。市場上有許多不同的商業(yè) ELISA 試劑盒可用于檢測 HIV、流感、登革熱、埃博拉、恰加斯病、利什曼病、萊姆病、西尼羅河病毒等。即使在植物病理學中，ELISA 技術(shù)也越來越受到關(guān)注。ELISA 成功克服了以前在植物診斷中進行的血清學分析的缺點

  

  懷孕測試

  

  許多不同的生物分子實體，包括人絨毛膜促性腺激素（hCG）、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雌三醇（E3）和促甲狀腺激素（TSH）可以因懷孕而表達。ELISA 可以在妊娠早期從母體血液、唾液或尿液中檢測到其中一些蛋白質(zhì)。HCG 是常見的激素之一，可在受精后第一個月通過 ELISA 檢測到。另一種與妊娠相關(guān)的生物分子是雌三醇 (E3)，可在妊娠第 6 周時通過唾液中的 ELISA 檢測到。

  

  癌癥檢測

  

  高靈敏度的癌癥檢測提供了早期診斷，這對于患者的生存至關(guān)重要。然而，癌癥生物標志物是作為目標分析物最具挑戰(zhàn)性的生物分子實體之一。ELISA 技術(shù)的進步有望應(yīng)用于癌癥生物標志物的檢測。

  

  ELISA實驗的優(yōu)缺點

  

  與其他免疫測定技術(shù)相比，ELISA 有許多優(yōu)點。elisa具有高靈敏度和特異性。與放射免疫分析 (RIA) 測試等其他技術(shù)相比，ELISA 還提供更高的準確性。

  

  ELISA 測定通常采用 96 孔微孔板。主要優(yōu)點是一次運行可進行 96 次測定，通常在 3 小時內(nèi)即可提供結(jié)果。這既快速又具有成本效益。

  

  ELISA 程序使用簡單。由于抗體和抗原之間的反應(yīng)，它具有出色的靈敏度和高特異性。ELISA 還非常高效，因為無需任何復(fù)雜的樣品預(yù)處理即可輕松進行同步分析。由于避免使用放射性物質(zhì)和大量有機溶劑，ELISA 測試既環(huán)保又安全。

  

  ELISA實驗所有方法的缺點很明顯：

  

  1、重復(fù)性不好；

  

  2、收自身抗體、嗜異性抗體等干擾，易出現(xiàn)假陽性；

  

  3、不論儀器和手工操作，干擾因素較多。影響最大的是溫度和時間。

  

  上述文章為大家介紹ELISA實驗的原理，通過了解ELISA實驗原理可以幫助我們更好的認識和提高ELISA實驗操作，為科研提供有利的技術(shù)支持。

  

  最后

  

  上海通蔚ELISA試劑盒采用經(jīng)過精心設(shè)計和篩選的抗原抗體對，保證了實驗的特異性和靈敏度，使您能夠準確地捕捉目標分子。

  

  上海通蔚生物始終堅持以客戶為中心，提供全面的技術(shù)支持和售后服務(wù)。我們的專業(yè)團隊將隨時為您解答實驗中遇到的問題，確保您的研究順利進行。