做ELISA實(shí)驗(yàn)需要注意哪些問(wèn)題？注意這4個(gè)要點(diǎn)

  “凡事預(yù)則立，不預(yù)則廢”。做ELISA實(shí)驗(yàn)也是如此，在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)要做足充分準(zhǔn)備。那么，在平時(shí)實(shí)驗(yàn)室做ELISA實(shí)驗(yàn)要注意哪些問(wèn)題呢？下面通蔚帶您從ELISA實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、標(biāo)準(zhǔn)品溶解、洗滌和標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)擬合及常見(jiàn)問(wèn)題等方面進(jìn)行闡述。

  ELISA操作前準(zhǔn)備

  1、試劑盒選擇。在進(jìn)行ELISA操作前，應(yīng)做好實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并根據(jù)樣本類(lèi)型、物種、檢測(cè)范圍、靈敏度、信譽(yù)度以及成本等因素選擇合適的ELISA試劑盒。同時(shí)，需要提前訂購(gòu)試劑盒和相關(guān)耗材，并根據(jù)說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備樣本、稀釋樣品、做好充分準(zhǔn)備工作。

  2、樣本處理。樣本制備是進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)前較為關(guān)鍵一步。標(biāo)本提倡新鮮的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，尤其是對(duì)于當(dāng)天收集的檢測(cè)標(biāo)本，即使暫時(shí)不用，建議分裝在后在4℃保存，在4℃保存建議不要超過(guò)72小時(shí)。如需長(zhǎng)期保存，應(yīng)將標(biāo)本分裝成小份后放在-20℃或-70℃條件下保存。標(biāo)本切記反復(fù)凍融，室溫和冰箱存在一定溫差，蛋白質(zhì)極易降解，直接影響實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。

  Elisa標(biāo)準(zhǔn)品溶解

  標(biāo)準(zhǔn)品是已知濃度的代測(cè)物質(zhì)，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，從而推算出未知樣品中待測(cè)物質(zhì)的濃度。因此標(biāo)準(zhǔn)品溶解、倍比稀釋和保存等細(xì)節(jié)要特別注意。操作標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)需格外小心，注意以下細(xì)節(jié)：

  1.復(fù)溶：根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，使用正確的復(fù)溶液，并使用移液槍緩慢地將復(fù)溶液加入凍干粉中，避免產(chǎn)生氣泡。輕輕旋轉(zhuǎn)或拍打管壁，使凍干粉充分溶解。靜置5-10分鐘后，短暫離心，收集管壁和蓋子上的液體。

  2.分裝和保存：將復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)一次用量分裝成小份，避免反復(fù)凍融。-70℃保存更適合長(zhǎng)期儲(chǔ)存，-20℃則更適合短期儲(chǔ)存(具體儲(chǔ)存溫度和時(shí)間請(qǐng)參考試劑盒說(shuō)明書(shū))。

  3.稀釋?zhuān)簻?zhǔn)備干凈的離心管并進(jìn)行編號(hào)，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)選擇合適的稀釋液。在獨(dú)立的管子中進(jìn)行系列稀釋?zhuān)苊庠贓LISA板內(nèi)進(jìn)行過(guò)多的倍比稀釋步驟。稀釋時(shí)，使用移液槍準(zhǔn)確吸取，并輕輕顛倒混勻，避免劇烈震蕩。建議使用進(jìn)口或硅化的EP管，以減少蛋白質(zhì)吸附。

  4.加入到ELISA板中：使用移液槍將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入到ELISA板的相應(yīng)孔中，注意槍頭不要刮劃孔底。

  5.穩(wěn)定性：標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后的穩(wěn)定性取決于具體的試劑盒，請(qǐng)仔細(xì)閱讀試劑盒說(shuō)明書(shū)，并在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)使用。

  ELISA操作中的洗滌

  洗滌是ELISA操作步驟中至關(guān)重要，如果洗滌不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致背景值高、假陽(yáng)性結(jié)果以及實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差等問(wèn)題。 因此，必須嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定的步驟、體積、時(shí)間和次數(shù)進(jìn)行洗滌操作，例如使用多道加樣器、吸管或洗板機(jī)等。下面通蔚為大家整理一些洗板小貼士，大家可以對(duì)照了解自己洗板操作是否正確。

  1、洗滌液不要溢出孔。在ELISA洗滌過(guò)程，洗滌液溢出孔容易交叉污染相鄰的孔，容易造成背景高，從而影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，尤其是在前兩次洗滌時(shí)，由于孔中殘留的未結(jié)合的抗體或抗原濃度較高，溢出后更容易污染相鄰孔，導(dǎo)致假陽(yáng)性信號(hào)。

  2、設(shè)置實(shí)驗(yàn)考慮孔位置。為了減少潛在的交叉污染，建議將空白孔、低濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔和陰性對(duì)照組放置在ELISA板的邊緣或單獨(dú)的區(qū)域。這樣可以盡量避免這些孔受到高濃度樣本或標(biāo)準(zhǔn)品的影響。

  正確的甩板方式對(duì)于減少交叉污染至關(guān)重要。甩板時(shí)，應(yīng)將ELISA板傾斜，使液體流向一側(cè)，然后在干凈的吸水紙上輕拍，以吸干殘留液體。避免旋轉(zhuǎn)甩板，因?yàn)檫@樣容易造成液體殘留和飛濺，增加交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。輕微的抖動(dòng)可以幫助去除殘留液體，但要確保液體不會(huì)飛濺到其他孔中。

  除了孔位置和甩板方式外，其他操作步驟也可能導(dǎo)致交叉污染。例如，加樣時(shí)應(yīng)避免槍頭接觸孔壁，洗滌時(shí)應(yīng)避免洗滌液溢出。應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并采取必要的預(yù)防措施，以最大程度地減少交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。最終的孔設(shè)置請(qǐng)參考所用試劑盒的說(shuō)明書(shū)。

  3、用干凈的濾紙，不要用衛(wèi)生紙。ELISA洗板后，拍干殘留液體是至關(guān)重要的步驟。為了避免污染和干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，強(qiáng)烈建議使用干凈的無(wú)塵紙或?qū)Ｓ肊LISA板吸水紙，而不是普通的衛(wèi)生紙。

  4、衛(wèi)生紙通常含有細(xì)小的纖維和粉塵，這些物質(zhì)容易脫落并粘附到孔中。這些污染物會(huì)干擾后續(xù)的反應(yīng)，導(dǎo)致背景值升高或吸附待測(cè)物質(zhì)，從而導(dǎo)致結(jié)果偏低或不準(zhǔn)確。此外，衛(wèi)生紙的吸水性也可能不如無(wú)塵紙或?qū)Ｓ梦?，?dǎo)致液體殘留，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。

  5、正確的拍干方式是將ELISA板倒扣在干凈的吸水紙上，并輕輕拍打板底，確保每個(gè)孔都充分接觸吸水紙，以吸干殘留液體。避免重復(fù)使用吸水紙，以防止交叉污染。使用干凈且合適的吸水材料對(duì)于確保ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。

  ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合

  ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合是ELISA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵步驟。一般情況下，應(yīng)優(yōu)先按照試劑盒說(shuō)明書(shū)推薦的擬合方法進(jìn)行操作。雖然部分酶標(biāo)儀可自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，也可手動(dòng)制作，但推薦使用酶標(biāo)儀配套軟件或?qū)I(yè)數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行擬合，以提高效率和減少人為誤差。

  ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)通常呈“S”形，兩端趨于水平，中間近似線(xiàn)性。中間的線(xiàn)性部分是最佳檢測(cè)范圍，靈敏度和準(zhǔn)確度最高。由于抗原抗體反應(yīng)的飽和效應(yīng)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度超過(guò)一定值后，即使繼續(xù)增加濃度，OD值也不再顯著變化，曲線(xiàn)趨于水平。廠商提供的推薦濃度范圍通常落在近似線(xiàn)性區(qū)域，但不一定完全在S形的正中間。

  根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可以計(jì)算待測(cè)樣本的濃度。然而，如果數(shù)據(jù)中存在“奇異點(diǎn)”（偏離整體趨勢(shì)的異常數(shù)據(jù)點(diǎn)）或“污點(diǎn)”（由于操作誤差，例如加樣錯(cuò)誤、污染等導(dǎo)致的無(wú)效數(shù)據(jù)點(diǎn)），直接進(jìn)行線(xiàn)性擬合或其他擬合可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。出現(xiàn)這種情況時(shí)，需要仔細(xì)檢查實(shí)驗(yàn)操作，找出異常值出現(xiàn)的原因。如果確定是操作誤差導(dǎo)致的“污點(diǎn)”，則可以剔除該數(shù)據(jù)點(diǎn)；如果是由于其他原因?qū)е碌摹捌娈慄c(diǎn)”，則需要謹(jǐn)慎考慮是否剔除，并根據(jù)具體情況選擇合適的處理方法。

  除了線(xiàn)性擬合，還可以采用其他擬合方法，例如雙對(duì)數(shù)擬合和四參數(shù)邏輯回歸(4PL)擬合。4PL擬合通常是ELISA數(shù)據(jù)處理中最常用的非線(xiàn)性擬合方法，因?yàn)樗芨鼫?zhǔn)確地描述S形曲線(xiàn)，尤其是在曲線(xiàn)兩端非線(xiàn)性較強(qiáng)的情況下。一些軟件還允許使用不同的權(quán)重，例如1/Y或1/Y2加權(quán)，以提高低濃度區(qū)域的擬合精度。選擇哪種擬合方法以及是否使用權(quán)重，需要根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)、數(shù)據(jù)的特點(diǎn)和分析目的進(jìn)行判斷。

  上述是做ELISA實(shí)驗(yàn)要注意的問(wèn)題，掌握上述ELISA注意事項(xiàng)，保證ELISA實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行至關(guān)重要。希望本文指導(dǎo)可以幫助您在未來(lái)實(shí)驗(yàn)中取得成功。