ELISA 實驗過程中的常見問題及解決

  上篇文章為大家介紹了《ELISA是什么？它能檢測出什么？》。相信大家對ELISA應用有所了解，不過在ELISA實驗中難免會出現(xiàn)問題，今天為大家介紹一下ELISA實驗中常見的問題以及對遇到問題的解決辦法。

  ELISA原理之前文章中有闡述，這里再簡要概述一下，了解ELISA原理有助于應對實驗遇到問題。

  Elisa的原理

  通過抗原與抗體的特異性免疫反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，用于定量測定。測定的對象可以是抗原也可以是抗體。

  在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化水解或氧化還原反應而成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。

  所生成有色產(chǎn)物的顏色深淺與欲測的抗原(抗體)含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(酶標儀)加以測定。其方法簡單，方便迅速，特異性強。

  Elisa對照

  每次進行ELISA時都應進行對照，以確保實驗的準確性。常見的對照包括陽性和陰性對照、空白孔和質(zhì)量控制樣品。陽性對照含有已知量的目標抗原，而陰性對照則不含?？瞻卓撞缓瑯悠坊蛟噭糜跍y量背景信號。質(zhì)量控制樣品用于驗證檢測的準確度和精密度。

  Elisa問題和解決方案

  空白（B）

  ELISA中使用空白對照孔（B）是為了控制板本身的變異，這些孔不接觸任何樣本或檢測抗體。如果空白孔的OD值升高，可能表明洗板存在問題，需要進一步調(diào)查。常見原因包括洗板機故障、底物過量或其他因素。

  零濃度(ZC)

  ELISA中的零濃度對照(ZC)與空白對照(B)類似，但包括檢測中使用的所有緩沖液和試劑，但不包含目標抗原。它可以幫助確定檢測的背景信號，對于計算真正的檢測限(LOD)至關重要。在實驗運行過程中，ZC的OD值應該保持穩(wěn)定，如果出現(xiàn)明顯變化，需要調(diào)查原因，例如洗板機故障、試劑問題或其他因素。定期檢查ZC對照的OD值，并及時排查問題，可以確保實驗結果的準確性。

  非特異性結合(NSB)

  NSB對照是ELISA中的另一種對照，它可以評估檢測抗體（標記抗體）對總OD信號的非特異性貢獻。在NSB對照中，通常不添加特異性抗原或樣品，而是僅將ELISA板與標記抗體和必要的緩沖液（如阻斷緩沖液）孵育。有時，還會采用增強的洗滌步驟來進一步減少非特異性結合。通過這種方式，NSB對照能夠區(qū)分由特異性抗原-抗體結合產(chǎn)生的信號與由非特異性因素（如標記抗體與ELISA板表面的非特異性吸附）產(chǎn)生的背景信號，從而提高實驗結果的準確性和可靠性。NSB對照的預期OD值應該略高于空白對照(B)孔，但低于零濃度對照(ZC)孔。如果NSB孔的OD值明顯高于預期，則可能表明標記抗體存在非特異性結合、封閉不充分或其他因素。正確的試劑制備和輸送對NSB對照和整個實驗結果的準確性至關重要。

  最大結合(MaxBinding)對照

  最大結合對照用于估計檢測所能產(chǎn)生的最大信號。它通過將過量的抗原或標準品加入到微孔板中，確保所有捕獲抗體都被結合，從而確定信號的上限。最大結合對照對于計算樣本的結合百分比、識別樣本、底物或檢測抗體的問題至關重要。

  通蔚建議

  Elisa實驗結果不一致或不準確的結果可能是由于各種因素造成的，例如試劑使用不當、孵育不均勻、移液技術不正確、交叉污染以及ELISA試劑盒質(zhì)量低劣。為了確保ELISA實驗結果的一致性和準確性，建議注意以下幾個方面：

  1.試劑管理:

  使用新鮮、適當稀釋的試劑，并在移液到板上之前充分混合。

  選擇黑值低、吸附性好的優(yōu)質(zhì)ELISA試劑盒。

  定期校準儀器，并使用標準品進行質(zhì)量控制。

  2.操作步驟:

  孵育期間使用板密封劑，并避光孵育底物。

  使用移液器時，每次移液前都應更換槍頭，并且不要讓移液器接觸孔底，以避免交叉污染。

  確保孵育溫度均勻，避免培養(yǎng)皿堆疊。

  嚴格按照實驗步驟進行操作，并記錄實驗過程。

  3.環(huán)境控制:

  避免陽光直射，避免溫度和濕度劇烈變化。

  保持工作區(qū)域清潔，防止污染。

  4.試劑盒質(zhì)量檢測:

  空白對照(B)和零濃度對照(ZC):評估試劑盒的背景信號和檢測限。

  最大結合對照(MaxBinding):評估試劑盒的靈敏度和飽和度。

  標準品:使用標準品驗證試劑盒的準確性和精密度。

  重復性:進行多次重復實驗，驗證試劑盒的結果重復性。

  最后，ELISA實驗過程遵循良好的實驗室規(guī)范，注意細節(jié)，并使用適當?shù)脑噭┨幚砗蛢Υ?，有助于?/span>ELISA實驗中獲得準確和一致的結果。