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  • 輪狀病毒A群染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

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    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目錄號 : TW37510
    • 應(yīng)用 : 僅供科研使用
    • 保存條件 : 低溫/避光保存
    • 貨期 : 現(xiàn)貨
    • 商品庫存：100
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產(chǎn)品及特點(diǎn)：
輪狀病毒 A 群（Rotavirus A）是嬰幼兒和幼畜腹瀉的主要病因之一，由其引起的腹瀉發(fā)病率很高。常見的傳播途徑為食用被污染的食品、水及生活接觸，然后通過人間傳播方式導(dǎo)致更多人感染。人感染輪狀病毒后臨床癥狀相似，主要表現(xiàn)為嘔吐和腹瀉，與其他病原造成的胃腸炎癥狀難以區(qū)別。本產(chǎn)品是基于染料法熒光定量 PCR 原理開發(fā)，專門檢測輪狀病毒 A 群的試劑盒。
1. 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照。
2. 根據(jù)輪狀病毒A群的保守基因序列設(shè)計的引物，具有良好的特異性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達(dá)到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。
規(guī)格及成分：

編號

成分

規(guī)格

試劑一

2×qRT-PCR 緩沖液

500 μL（棕色管）

試劑二

10×qRT-PCR 酶混合液

100 μL（紅蓋）

試劑三

ROX 染料 I，50×

20 μL（棕色管）

試劑四

ROX 染料 II，50×

20 μL（棕色管）

試劑五

熒光 PCR 專用模板稀釋液

1mL（黃蓋）

試劑六

輪狀病毒A群染料法 qRT-PCR 引物混合液

100 μL（白蓋）

試劑七

輪狀病毒A群染料法 qRT-PCR 陽性對照 （1×10E8 /μL）

50 μL（黃蓋）

試劑八

沙核酸釋放劑（試用裝）

20 次（1mL，綠蓋）

試劑九

使用手冊

1 份

運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。
陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 DNA 片段作為陽性對照。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法：  
一、稀釋陽性對照： 
以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例，由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。
1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備：  
5. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。
6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置RT-PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）：
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個，其余不變。
8. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加）：

成分

N+2個制備

所得樣品

qRT-PCR

陰性對照

qRT-PCR陽性對照(2-7管)

2×qRT-PCR緩沖液

10μL

10μL

各10μL

輪狀病毒A群染料法qRT-PCR引物混合物

2μL

2μL

各2μL

50×ROX (見注)

0.4μL

0.4μL

各0.4μL

樣品制備所得RNA

模板(來于第8步)

5.6μL

--

--

稀釋所得6個陽性對照 (來于第6步)

--

--

各5.6μL2號樣到2號 管,3號樣到3號管

超純水

--

5.6μL

--

10×qRT-PCR酶混合液

2μL

2μL

2μL

注： 需使用 ROX 染料 I 的機(jī)型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的機(jī)型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的機(jī)型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）。

過程

溫度

時間

RT（逆轉(zhuǎn)錄）

50℃

15-30 min

預(yù)變性

95℃

5 min

Qrt-PCR反應(yīng)40個循環(huán)

95℃

15 sec

58℃

1 min,（采集FAM通道的熒光信號）

按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理：
10. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！