產(chǎn)品及特點(diǎn):
傳染性肌肉壞死病病毒(Infectious Myonecrosis Virus,IMNV)是一種 RNA病毒,多感染蝦類,感染時體色發(fā)白,腹節(jié)發(fā)紅,尾部肌肉組織呈點(diǎn)狀或擴(kuò)散的壞死癥狀,體表有不規(guī)則黑斑,則可初步斷定患有傳染性肌肉壞死病。凡納濱對蝦目前是主要易感種類,在整個養(yǎng)殖過程中均可感染,養(yǎng)殖在海水和低鹽度的咸淡水中的幼蝦和半成蝦最容易受到感染。該病發(fā)病緩慢,累計(jì)死亡率高達(dá) 70%,該病的發(fā)生會給養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失,因此傳染性肌肉壞死病病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品基于 PCR 原理開發(fā)。
1. 一站式,用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分,包括引物和對照。
2. 根據(jù)傳染性肌肉壞死病病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物,具有良好的特異性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測,靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍,可以達(dá)到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù),RT 和 PCR 兩步在一個試管內(nèi)完成,不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。
規(guī)格及成分:
編號
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成分
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規(guī)格
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試劑一
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2×qRT-PCR 緩沖液
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500 μL(棕色管)
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試劑二
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10×qRT-PCR 酶混合液
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100 μL(紅蓋)
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試劑三
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ROX 染料 I,50×
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20 μL(棕色管)
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試劑四
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ROX 染料 II,50×
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20 μL(棕色管)
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試劑五
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熒光 PCR 專用模板稀釋液
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1mL(黃蓋)
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試劑六
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傳染性肌肉壞死病病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液
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100 μL(白蓋)
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試劑七
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傳染性肌肉壞死病病毒染料法 qRT-PCR 陽性對照 (1×10E8 /μL)
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50 μL(黃蓋)
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試劑八
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沙核酸釋放劑(試用裝)
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20 次(1mL,綠蓋)
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試劑九
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使用手冊
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1 份
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運(yùn)輸及保存:
低溫運(yùn)輸、-20℃保存,有效期一年。
陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供 DNA 片段作為陽性對照。
自備試劑:
樣品 RNA。
使用方法:
一、稀釋陽性對照:
以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例,由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。
1. 標(biāo)記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
3. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備:
5. 如果有 N 個樣品,必須設(shè)置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL,10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)??梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。
6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置RT-PCR 反應(yīng)(20 μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行):
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照,6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號陽性對照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟,定性分析只是把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個,其余不變。
8. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加):
成分
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N+2個制備
所得樣品
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qRT-PCR
陰性對照
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qRT-PCR陽性對照(2-7管)
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2×qRT-PCR緩沖液
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10μL
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10μL
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各10μL
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傳染性肌肉壞死病病毒染料法qRT-PCR引物混合物
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2μL
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2μL
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各2μL
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50×ROX (見注)
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0.4μL
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0.4μL
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各0.4μL
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樣品制備所得RNA
模板(來于第8步)
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5.6μL
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稀釋所得6個陽性對照 (來于第6步)
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各5.6μL2號樣到2號 管,3號樣到3號管
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超純水
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5.6μL
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10×qRT-PCR酶混合液
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2μL
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2μL
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2μL
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注:需使用 ROX 染料 I 的機(jī)型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的機(jī)型:ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的機(jī)型:Thermal Cycle Dice Real Time System,LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR(參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化)。
過程
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溫度
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時間
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RT(逆轉(zhuǎn)錄)
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50℃
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15-30 min
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預(yù)變性
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95℃
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5 min
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Qrt-PCR反應(yīng)40個循環(huán)
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95℃
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15 sec
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58℃
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1 min,(采集FAM通道的熒光信號)
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按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析
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四、數(shù)據(jù)處理:
10. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值,再推算出其濃度。
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴(kuò)增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 40,則為陽性。
五、特別提示:
本公司的所有產(chǎn)品,僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!