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021-54845833/15800441009
產(chǎn)品及特點：
1. 一站式，用于不需要單獨準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照。
2. 根據(jù)蘋果銹果類病毒的保守基因序列設(shè)計的引物，具有良好的特異性。
3. 基于染料法qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規(guī) RT-PCR高10-100 倍，可以達到至少1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR 兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠50次30μL 體系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。
規(guī)格及成分：
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編號 |
成分 |
規(guī)格 |
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試劑一 |
2×qRT-PCR 緩沖液 |
500 μL(棕色管) |
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試劑二 |
10×qRT-PCR 酶混合液 |
100 μL(紅蓋) |
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試劑三 |
ROX 染料 I，50× |
20 μL(棕色管) |
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試劑四 |
ROX 染料 II，50× |
20 μL(棕色管) |
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試劑五 |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 |
1mL(黃蓋) |
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試劑六 |
蘋果銹果類病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液 |
100 μL(白蓋) |
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試劑七 |
蘋果銹果類病毒染料法 qRT-PCR 陽性對照 (1×10E8 /μL) |
50 μL(黃蓋) |
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試劑八 |
沙核酸釋放劑(試用裝) |
20 次(1mL，綠蓋) |
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試劑九 |
使用手冊 |
1 份 |
低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 DNA 片段作為陽性對照。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法：
一、稀釋陽性對照：
以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例，由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原。
1. 標(biāo)記 6個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同)。
2. 在7號管中加入 5μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
3. 換槍頭，在 6 號管中加入5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5號管中加入5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備：
5. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照)，一個是 NC(樣品制備陰性對照)?？梢杂?10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽性對照(加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。
6. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置RT-PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進行）：
7. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2個樣品，1個用于PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于 PCR陰性對照(用水做模板)，1 個用于 PCR陽性對照(用第 4號陽性對照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1個，其余不變。
8. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加)：
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成分 |
N+2個制備 所得樣品 |
qRT-PCR 陰性對照 |
qRT-PCR陽性對照(2-7管) |
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2×qRT-PCR緩沖液 |
10μL |
10μL |
各10μL |
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蘋果銹果類病毒染料法qRT-PCR引物混合物 |
2μL |
2μL |
各2μL |
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50×ROX (見注) |
0.4μL |
0.4μL |
各0.4μL |
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樣品制備所得RNA 模板(來于第8步) |
5.6μL |
-- |
-- |
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稀釋所得6個陽性對照 (來于第6步) |
-- |
-- |
各5.6μL2號樣到2號 管,3號樣到3號管 |
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超純水 |
-- |
5.6μL |
-- |
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10×qRT-PCR酶混合液 |
2μL |
2μL |
2μL |
需使用 ROX 染料 II 的機型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的機型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上機后按下面參數(shù)進行 RT-PCR(參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化)。
過程
溫度
時間
RT（逆轉(zhuǎn)錄）
50℃
15-30 min
預(yù)變性
95℃
5 min
Qrt-PCR反應(yīng)40個循環(huán)
95℃
15 sec
58℃
1 min,（采集FAM通道的熒光信號）
按儀器預(yù)設(shè)程序進行溶解曲線分析
四、數(shù)據(jù)處理：
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
