產(chǎn)品及特點(diǎn):
豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)會(huì)引起豬細(xì)小病毒病。這是一種豬繁殖障礙病,該病主要表現(xiàn)為胚胎和胎兒的感染和死亡,特別是初產(chǎn)母豬發(fā)生死胎、畸形胎和木乃伊胎,但母豬本身無(wú)明顯的癥狀。豬群暴發(fā)此病時(shí)常與窩仔數(shù)減少、母豬難產(chǎn)和重復(fù)配種等臨床表現(xiàn)有關(guān)。在懷孕早期 30-50 天感染,胚胎死亡或被吸收,使母豬不孕和不規(guī)則地反復(fù)發(fā)情,該病毒會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失,因此豬細(xì)小病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。它具有下列特點(diǎn):
1. 即開(kāi)即用,用戶(hù)只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)豬細(xì)小病毒保守序列設(shè)計(jì)的專(zhuān)一性引物,與相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測(cè),避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
規(guī)格及成分:
編號(hào)
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成分
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規(guī)格
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試劑一
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2×qPCR MagicMix
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500 μL(棕色管)
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試劑二
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熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液
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1 mL(黃蓋)
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試劑三
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豬細(xì)小病毒染料法PCR 引物混合液
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100 μL(白蓋)
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試劑四
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豬細(xì)小病毒染料法PCR 陽(yáng)性對(duì)
照(1×10E8 /μL)
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50 μL(紅蓋)
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試劑五
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DNA 病毒裂解液(試用裝)
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15 次(9 mL)
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使用手冊(cè)
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1 份
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運(yùn)輸及保存:
低溫運(yùn)輸、-20℃保存,有效期一年。
自備試劑:
DNA 模板、10×ROX(根據(jù)機(jī)型決定,具體見(jiàn)使用方法)。
使用方法:
一、稀釋PCR陽(yáng)性對(duì)照(以10E2-10E7拷貝/μL這6 個(gè) 10倍稀釋度為例):
1. 注意:由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液(最好用帶芯槍頭,下同)。
4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
6. 換槍頭,在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 5 號(hào)管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備:
8. 如果有 N 個(gè)樣品,必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取,多出的一個(gè)是 PC(樣品制備陽(yáng)性對(duì)照),一個(gè)是 NC(樣品制備陰性對(duì)照)??梢杂?10μL 上步制備的 PCR 陽(yáng)性對(duì)照的第 4號(hào)(濃度為 1×10E4 拷貝/μL,10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝)或第 5 號(hào)(濃度為 1×10E5拷貝/μL,10μL 相當(dāng)于 10 萬(wàn)拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品,則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
9. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 15 次一管式病毒 DNAout。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)(20 μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行):
10. 如果只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照,6 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照。如果做 2-3 次重復(fù),則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加):
成分
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樣品管 N+2 個(gè)
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PCR陰性對(duì)照管
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PCR陽(yáng)性對(duì)照管2-7 管
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2×qPCR MagicMix (棕色管)
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10μL
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10 μL
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各 10 μL
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豬細(xì)小病毒PCR引物混合液(白蓋)
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2 μL
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2 μL
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各2 μL
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自備 10×ROX (見(jiàn)注)
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2 μL
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2 μL
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各 2 μL
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N+2 待測(cè)樣品 DNA 模板
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6 μL
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不加
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不加
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第7步所得PCR陽(yáng)性對(duì)照稀釋液2-7 號(hào)
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不加
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不加
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各6μL2號(hào)樣到2號(hào)管3號(hào)樣到3號(hào)管…
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注: 僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照,其他熒光 PCR 儀器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,則用水替代。
12.蓋上蓋子后上機(jī),按下面參數(shù)進(jìn)行PCR(具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化)。
過(guò)程
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溫度
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時(shí)間
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預(yù)變性
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92℃
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5分鐘
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PCR反應(yīng)30個(gè)循環(huán)
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94℃
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60秒
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50℃
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60秒
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72℃
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60秒
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13. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí),最大吸收光譜在 471 nm,結(jié)合 DNA 時(shí)的最大吸收光譜在 500 nm,最大發(fā)射光譜在 530 nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理:
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上推算出樣品 DNA 濃度的log 值,再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),只判斷陽(yáng)性或陰性,則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),有典型擴(kuò)增曲線(xiàn),Ct 值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽(yáng)性。
五、特別提示:
本公司的所有產(chǎn)品,僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!