產(chǎn)品及特點(diǎn):
馬動(dòng)脈炎病毒(EquineArteritisVirus,EAV)是一種 RNA 病毒,病馬出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞減少為特征的白細(xì)胞減少癥,臨診病期大約 14 天,表現(xiàn)厭食、精神沉郁、四肢嚴(yán)重水腫,步伐僵直,眼、鼻分泌物增加,面部、頸部、臀部形成皮膚疹塊,因此馬動(dòng)脈炎病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品是以探針?lè)晒舛?PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的馬動(dòng)脈炎病毒探針?lè)晒舛縍T-PCR 試劑盒,它具有下列特點(diǎn):
1. 即開(kāi)即用,用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化,靈敏性高。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照,便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高,引物是根據(jù)馬動(dòng)脈炎病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針?lè)晒舛?RT-PCR 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分:
編號(hào)
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成分
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規(guī)格
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試劑一
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探針?lè)?qRT-PCR 緩沖液
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500 μL(藍(lán)蓋)
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試劑二
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探針?lè)?qRT-PCR 酶混合液
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100 μL(紅蓋)
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試劑三
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熒光 PCR 專用模板稀釋液
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1 mL(黃蓋)
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試劑四
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馬動(dòng)脈炎病毒探針?lè)╭RT-PCR引物混合液
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100 μL(白蓋)
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試劑五
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馬動(dòng)脈炎病毒 qRT-PCR 探針
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50 μL(棕色管)
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試劑六
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馬動(dòng)脈炎病毒探針?lè)╭RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照(1×10E8/μL)
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50 μL(黃蓋)
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使用手冊(cè)
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1 份
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運(yùn)輸及保存:
低溫運(yùn)輸、-20℃保存,有效期一年。
自備試劑:
樣品 RNA。
使用方法:
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例):
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備:
7. 如果有 N 個(gè)樣品,最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取,多出的一個(gè)是 PC(樣品制備陽(yáng)性對(duì)照),一個(gè)是 NC(樣品制備陰性對(duì)照)。可以用 10μL 陽(yáng)性對(duì)照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 RNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的柱式病毒 RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)(20μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行):
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用水做模板),6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用水做模板),1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照(用第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加):
成份
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樣品管N+2個(gè)
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RT-PCR陰性對(duì)照管
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標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管2-7管
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探針?lè)?qRT-PCR 緩沖液
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各 10 μL
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10 μL
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各 10 μL
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探針?lè)?qRT-PCR 酶混合液
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各 2 μL
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2 μL
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各 2 μL
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馬動(dòng)脈炎病毒 qRT-PCR 探針
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各 1 μL
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1 μL
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各 1 μL
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馬動(dòng)脈炎病毒探針qRT-PCR引物混合液
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各 2 μL
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2 μL
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各 2 μL
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待測(cè)樣品 RNA 模板
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各 5 μL
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--
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超純水
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5 μL
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第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液2-7號(hào)
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不加
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不加
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各5 μL (2號(hào)樣到2號(hào)管,3號(hào)樣到3號(hào)管)
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11. 蓋上蓋子后上機(jī),按下面參數(shù)進(jìn)行 qRT-PCR:
過(guò)程
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溫度
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時(shí)間
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逆轉(zhuǎn)錄
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50℃
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30 min
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預(yù)變性
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94℃
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10 min
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qRT-PCR反應(yīng)35個(gè)循環(huán)
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94℃
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15 sec
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60℃
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1 min,(采集FAM通道的熒光信號(hào))
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四、數(shù)據(jù)處理:
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),只判斷陽(yáng)性或陰性,則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),有典型擴(kuò)增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 40,則為陽(yáng)性。
五、特別提示:
本公司的所有產(chǎn)品,僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!