HA抗體親和凝膠

純化，免疫沉淀

1. 純化

1.1 填料準(zhǔn)備：取適量的凝膠加入層析柱中，流干保存液，加入5倍柱體積（凝膠體積）的平衡液清洗。

1.2 加入樣品溶液，室溫震蕩孵育30分鐘(不能用磁力攪拌器攪拌)，確保填料與樣品溶液充分混合。

1.3 孵育完畢后，將填料混合液離心：1000g，5分鐘，或過(guò)濾收集填料。

1.4 將填料裝入層析柱中，用平衡液清洗4-5次，直至紫外檢測(cè)值穩(wěn)定。

1.5 洗脫 1.5.1 酸性洗脫：加入5倍柱體積的酸性洗脫液，收集管中預(yù)先加好中和液50 μl中和液/ml洗脫液，分管收集。 注意：酸性洗脫后填料要立即用平衡液平衡，Anti-HA Affinity gel在洗脫液中不要超過(guò)20分鐘。

1.5.2 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫：使用5倍柱體積的競(jìng)爭(zhēng)性洗脫液HA多肽0.5 mg/ml洗脫，30℃孵育10-15分鐘，重復(fù)1-2次，分管收集。

1.6 使用3倍柱體積的酸性洗脫液再生凝膠，然后用平衡液平衡至中性。 1.7 加入保存液，2-8℃保存。

2. 免疫沉淀 2.1 取20-100μl的Anti-HA Affinity gel加入到2ml 離心管中，離心：5000g，30秒，棄去上清。

2.2 加入0.5ml平衡液，懸浮填料，離心：5000g，30秒，棄去上清。重復(fù)一次。

2.3 加入200-1000μl樣品裂解液，與填料混合均勻，置于旋轉(zhuǎn)混合儀上輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，使樣品和填料充分接觸并吸附，室溫1小時(shí)。混勻后離心：5000g，30秒，吸取上清，留樣檢測(cè)。

2.4 洗滌：加入0.5ml的洗滌液，懸浮填料，進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，離心：5000g，30秒，棄去上清。重復(fù)3次。

2.5 變性洗脫：加入5μl 5X變性洗脫液，沸水浴煮沸5分鐘。離心：5000g，30秒，吸取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

注意：變性洗脫液中含有SDS，會(huì)使偶聯(lián)的HA抗體變性，洗脫后的凝膠不可重復(fù)使用。