1. 純化
1.1 填料準(zhǔn)備:取適量的凝膠加入層析柱中,流干保存液,加入5倍柱體積(凝膠體積)的平衡液清洗。
1.2 加入樣品溶液,室溫震蕩孵育30分鐘(不能用磁力攪拌器攪拌),確保填料與樣品溶液充分混合。
1.3 孵育完畢后,將填料混合液離心:1000g,5分鐘,或過(guò)濾收集填料。
1.4 將填料裝入層析柱中,用平衡液清洗4-5次,直至紫外檢測(cè)值穩(wěn)定。
1.5 洗脫 1.5.1 酸性洗脫:加入5倍柱體積的酸性洗脫液,收集管中預(yù)先加好中和液50 μl中和液/ml洗脫液,分管收集。 注意:酸性洗脫后填料要立即用平衡液平衡,Anti-HA Affinity gel在洗脫液中不要超過(guò)20分鐘。
1.5.2 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫:使用5倍柱體積的競(jìng)爭(zhēng)性洗脫液HA多肽0.5 mg/ml洗脫,30℃孵育10-15分鐘,重復(fù)1-2次,分管收集。
1.6 使用3倍柱體積的酸性洗脫液再生凝膠,然后用平衡液平衡至中性。 1.7 加入保存液,2-8℃保存。
2. 免疫沉淀 2.1 取20-100μl的Anti-HA Affinity gel加入到2ml 離心管中,離心:5000g,30秒,棄去上清。
2.2 加入0.5ml平衡液,懸浮填料,離心:5000g,30秒,棄去上清。重復(fù)一次。
2.3 加入200-1000μl樣品裂解液,與填料混合均勻,置于旋轉(zhuǎn)混合儀上輕輕旋轉(zhuǎn)離心管,使樣品和填料充分接觸并吸附,室溫1小時(shí)。混勻后離心:5000g,30秒,吸取上清,留樣檢測(cè)。
2.4 洗滌:加入0.5ml的洗滌液,懸浮填料,進(jìn)行清洗,去除非特異性吸附的雜蛋白,離心:5000g,30秒,棄去上清。重復(fù)3次。
2.5 變性洗脫:加入5μl 5X變性洗脫液,沸水浴煮沸5分鐘。離心:5000g,30秒,吸取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。
注意:變性洗脫液中含有SDS,會(huì)使偶聯(lián)的HA抗體變性,洗脫后的凝膠不可重復(fù)使用。
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