什么是標(biāo)記抗體？一文帶您了解標(biāo)記抗體及作用

  抗體標(biāo)記，即在抗體上附加特定標(biāo)簽以幫助檢測(cè)或分離/純化蛋白質(zhì)，是一項(xiàng)重要技術(shù)。標(biāo)記抗體對(duì)于免疫印跡、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)(IHC)和免疫熒光(IF)等免疫檢測(cè)法至關(guān)重要。標(biāo)記抗體還用于從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離和純化單個(gè)蛋白質(zhì)。與其他蛋白質(zhì)一樣，抗體可以用小分子、放射性同位素、酶蛋白和熒光染料標(biāo)記。

  傳統(tǒng)上，通常采用兩種不同的化學(xué)方法將抗體與小分子共價(jià)標(biāo)記：

  該標(biāo)記物與一級(jí)胺反應(yīng)，用于標(biāo)記抗體分子中的賴氨酸殘基

  抗體鏈內(nèi)的二硫鍵被還原，然后與硫醇反應(yīng)性標(biāo)記物發(fā)生反應(yīng)

  然而，已經(jīng)開發(fā)出新的方法，包括將標(biāo)簽非共價(jià)添加到抗體的Fc部分，或?qū)?biāo)簽共價(jià)添加到抗體重鏈的N連接聚糖上。

  所用標(biāo)記類型取決于下游應(yīng)用。上海通蔚生物將重點(diǎn)介紹抗體的非放射性標(biāo)記及其用途。

圖1.直接夾心 ELISA，使用捕獲抗體和一抗

  生物素

  生物素是一種小分子（244.3Da），可與其結(jié)合伙伴親和素（存在于蛋清中）和鏈霉親和素（由細(xì)菌鏈霉菌產(chǎn)生）形成自然界中發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的非共價(jià)相互作用之一。由于其大小，生物素很少會(huì)干擾抗體的活性，因此使其成為標(biāo)記的良好選擇。

  生物素標(biāo)記抗體用于Westerns、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光和免疫組織化學(xué)，當(dāng)抗原難以檢測(cè)時(shí)，通常使用生物素標(biāo)記抗體來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度。通常，印跡或樣品與生物素標(biāo)記抗體一起孵育，然后再與用酶或熒光染料標(biāo)記的親和素或鏈霉親和素一起孵育?？贵w通常與多個(gè)生物素分子（3-6個(gè)分子）結(jié)合，從而產(chǎn)生擴(kuò)增步驟，增強(qiáng)對(duì)較少抗原的檢測(cè)。雖然生物素標(biāo)簽可以改善檢測(cè)，但它可能難以用于蛋白質(zhì)的分離/純化，因?yàn)樯锼睾停ㄦ溍梗┯H和素之間的強(qiáng)相互作用很難破壞。

  許多公司出售含有活性生物素分子的生物素化試劑盒，可輕松標(biāo)記蛋白質(zhì)。通常，抗體通過(guò)使用生物素類似物的N-羥基琥珀酰亞胺酯標(biāo)記在賴氨酸的ε-氨基上。生物素使用至少6個(gè)原子的間隔臂附著在蛋白質(zhì)上，以防止下游操作過(guò)程中的空間位阻。間隔臂的長(zhǎng)度和組成可以變化，以優(yōu)化測(cè)定。

  酶報(bào)告基因

  傳統(tǒng)上，Western、ELISA和IHC中最常用的抗體標(biāo)記是酶報(bào)告標(biāo)記。酶標(biāo)記比生物素大，但它們很少干擾抗體功能。最常用的酶標(biāo)記是辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶。

  要使用酶標(biāo)記抗體，需要將樣品與酶特異性底物一起孵育，酶催化該底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物（顯色測(cè)定）或光（化學(xué)發(fā)光測(cè)定）。每種酶都有一組可用的底物和檢測(cè)方法。例如，HRP可以與二氨基聯(lián)苯胺反應(yīng)產(chǎn)生棕色產(chǎn)物，或與魯米諾反應(yīng)產(chǎn)生光。相反，AP可以與對(duì)硝基苯基磷酸鹽(pNPP)反應(yīng)產(chǎn)生黃色產(chǎn)物（分光光度計(jì)可檢測(cè)到），或與5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)和硝基藍(lán)四唑(NBT)反應(yīng)產(chǎn)生紫色沉淀。顯色測(cè)定適用于蛋白質(zhì)印跡、ELISA和IHC，而發(fā)光反應(yīng)最常用于蛋白質(zhì)印跡。許多具有不同靈敏度和輸出的底物可用于檢測(cè)，這使得酶報(bào)告基因成為最受歡迎的抗體標(biāo)記之一。

  雖然報(bào)告酶也與賴氨酸的ε-氨基結(jié)合，但由于酶含有賴氨酸并具有多聚化的潛力，因此可以使用其他化學(xué)方法。酶標(biāo)記的二抗在多家公司廣泛供應(yīng)，而其他公司則銷售用于在實(shí)驗(yàn)室中標(biāo)記抗體的試劑盒。

  熒光標(biāo)簽

  實(shí)驗(yàn)室中熒光標(biāo)記抗體的使用正在穩(wěn)步增加。由于熒光染料直接與抗體結(jié)合，因此檢測(cè)不需要酶/底物或結(jié)合相互作用。因此，檢測(cè)到的熒光信號(hào)量與樣品中的目標(biāo)蛋白量成正比。熒光標(biāo)記用于熒光蛋白質(zhì)印跡分析、流式細(xì)胞術(shù)和IF，可用于高度定量分析。

  要檢測(cè)熒光標(biāo)記，需要一種儀器，該儀器發(fā)射特定波長(zhǎng)的光來(lái)激發(fā)熒光染料。然后，熒光染料會(huì)發(fā)出不同波長(zhǎng)的信號(hào)。同一儀器包含適當(dāng)?shù)臑V光片，用于檢測(cè)熒光染料的發(fā)射。流式細(xì)胞術(shù)需要使用流式細(xì)胞儀，而IF則使用熒光顯微鏡。Western印跡通常采用數(shù)字成像系統(tǒng)?？贵w可以用各種具有不同激發(fā)和發(fā)射光譜的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。除了高度定量外，熒光標(biāo)記還具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，即能夠通過(guò)使用具有不重疊發(fā)射光譜的染料來(lái)同時(shí)多路復(fù)用或檢測(cè)兩種或多種不同的目標(biāo)蛋白。

對(duì)于標(biāo)記，熒光標(biāo)簽可以通過(guò)一級(jí)胺或硫醇基團(tuán)共價(jià)連接到抗體上。熒光標(biāo)記抗體可從許多公司購(gòu)買，或者可以使用商業(yè)試劑盒在實(shí)驗(yàn)室中標(biāo)記抗體。