一文讀懂酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）原理及步驟

  酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）是一種廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究和臨床診斷的免疫分析技術(shù)。該技術(shù)利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，通過酶促反應(yīng)將待測物質(zhì)的存在與可檢測的信號（例如顏色變化）聯(lián)系起來，從而實現(xiàn)對目標(biāo)分子的定性和定量分析。ELISA具有高靈敏度、高特異性、操作簡便、成本效益高等優(yōu)點，使其成為研究人員和臨床醫(yī)生常用的工具。

ELISA試劑盒

  ELISA可以用于檢測多種類型的生物分子，包括蛋白質(zhì)、肽、激素、抗體、細(xì)胞因子等。其應(yīng)用范圍涵蓋免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等多個領(lǐng)域。例如，ELISA可以用于：

•   檢測疾病標(biāo)志物：輔助疾病的診斷、預(yù)后評估和治療監(jiān)測

•   研究蛋白質(zhì)表達(dá)和功能：分析細(xì)胞信號通路和蛋白質(zhì)相互作用

•   藥物開發(fā)和篩選：評估藥物的療效和安全性

•   食品安全檢測：檢測食品中的污染物和毒素

•   環(huán)境監(jiān)測：檢測環(huán)境樣品中的污染物

  本文將詳細(xì)介紹ELISA技術(shù)的原理、類型步驟、應(yīng)用和注意事項，幫助讀者全面了解和掌握這項重要的實驗技術(shù)。

  ELISA技術(shù)原理

  酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合的檢測技術(shù)，將已知抗原和抗體結(jié)合在固相載體（酶標(biāo)板）表面，并保持其免疫活性。測定時，將待檢樣本加入固相載體，使其與表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。隨后，加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，進(jìn)一步形成復(fù)合物。 通過洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入酶底物進(jìn)行顯色反應(yīng)。 根據(jù)顯色結(jié)果，可以定性或定量分析目標(biāo)分子的存在和含量。

圖1  ELISA原理

  ELISA實驗中常見的試劑

•   固相抗原和抗體。固相抗原和抗體是ELISA實驗關(guān)鍵試劑，抗原和抗體在酶標(biāo)板特異性結(jié)合反應(yīng)解決生物學(xué)科研難題。

•   酶標(biāo)記抗體。酶標(biāo)記抗體是鏈接特異性抗原識別和信號放大橋梁。它能夠識別并結(jié)合樣品中目標(biāo)抗原上的特定抗原表位，并偶聯(lián)一種酶（例如辣根過氧化物酶 HRP 或堿性磷酸酶 AP），加入底物，酶會催化底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測的信號。

•   底物。底物是實驗最后階段，它和沒標(biāo)記抗體反應(yīng)時，實驗的結(jié)果將在酶標(biāo)板上顯出色彩和熒光劑。

  ELISA常見的類型及步驟

  直接法ELISA

  將抗原按一定的比例稀釋好包被到固相載體上，然后加入稀釋好的特異性的酶標(biāo)抗體，孵育后加入底物顯色并判讀結(jié)果。

圖2 直接ELISA法

  直接ELISA法步驟：

•   將已知的抗原按一定比例稀釋后，包被到酶標(biāo)板或其他固相載體表面，形成一層抗原涂層。

•   加入針對該抗原的特異性酶標(biāo)抗體，使其與固相載體上的抗原結(jié)合。在適宜的溫度和時間下孵育，使抗原抗體充分結(jié)合。去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。

•   加入酶的底物，底物被酶催化后發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測的顏色變化。 根據(jù)顯色結(jié)果，可以定性或定量分析樣品中目標(biāo)抗原的存在和含量。

  直接法ELISA的優(yōu)點是：

•   操作步驟簡單，耗時短。

•   不需要使用二抗，避免了二抗可能帶來的交叉反應(yīng)。

  直接法ELISA的缺點是：

•   靈敏度較低，不適用于檢測低豐度抗原。

•   每種靶抗原都需要制備相應(yīng)的酶標(biāo)抗體，成本較高。

  間接法ELISA

  將已知抗原連接在固相載體上，待測抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原一待測抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測抗體量成正比，屬非競爭性反應(yīng)類型。

圖3 間接法ELISA

間接法ELISA步驟：

  

• 將已知抗原固定在固相載體上：類似于直接法ELISA，首先將已知的抗原包被到酶標(biāo)板或其他固相載體表面。

•   加入待測抗體：加入待測樣本（例如血清），如果樣品中含有針對該抗原的特異性抗體，則會與固相載體上的抗原結(jié)合。

•   加入酶標(biāo)二抗：加入帶有酶標(biāo)記的二抗，二抗可以識別并結(jié)合待測抗體的Fc段。

•   孵育、洗滌、顯色、判讀結(jié)果：與直接法ELISA類似，經(jīng)過孵育、洗滌、顯色等步驟后，根據(jù)顯色結(jié)果可以判斷樣品中是否存在針對該抗原的特異性抗體，并進(jìn)行定量分析。

  間接法ELISA的優(yōu)點是：

•   靈活性高，可以使用一種酶標(biāo)二抗檢測多種不同的抗體，只需更換固相抗原即可。

•   靈敏度較高，因為二抗可以放大信號。

  間接法ELISA的缺點是：

•   操作步驟比直接法ELISA復(fù)雜，耗時較長。

•   可能會發(fā)生非特異性結(jié)合和交叉反應(yīng)，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

  夾心法ELISA

  夾心法ELISA分為直接夾心法和間接夾心法，檢測抗體是酶標(biāo)抗體，則可稱為直接夾心ELISA；檢測抗體不帶有標(biāo)記，則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合，這種稱為間接夾心ELISA。

圖4 夾心法ELISA

  夾心法 ELISA 步驟：

•   包被捕獲抗體：將捕獲抗體固定在ELISA板上。

•   加入待測樣品：加入待測樣品，如果樣品中含有目標(biāo)抗原，則會被捕獲抗體捕獲。

•   加入檢測抗體：加入檢測抗體，檢測抗體可以識別并結(jié)合目標(biāo)抗原上的另一個表位。

•   后續(xù)步驟：根據(jù)檢測抗體是否帶有酶標(biāo)記，進(jìn)行直接或間接ELISA的后續(xù)步驟(孵育、洗滌、顯色、判讀結(jié)果)。

  夾心法ELISA優(yōu)點：

•   高靈敏度：由于使用了兩種抗體來識別抗原，夾心法ELISA具有很高的靈敏度，可以檢測到低豐度的抗原。

•   高特異性：兩種抗體識別抗原上不同的表位，大大降低了非特異性結(jié)合和交叉反應(yīng)的可能性，提高了檢測的特異性。

•   適用范圍廣：可以用于檢測多種類型的抗原，包括蛋白質(zhì)、多肽、激素等。

•   操作相對簡單：與競爭法ELISA相比，夾心法ELISA的操作步驟相對簡單。

  夾心法ELISA缺點：

•   需要配對抗體：進(jìn)行夾心法ELISA需要兩種針對不同表位的抗體，配對抗體的選擇和驗證比較關(guān)鍵，也增加了實驗成本。

•   不適用于小分子抗原：夾心法ELISA需要抗原具有至少兩個抗體結(jié)合位點，因此不適用于檢測小分子抗原。

•   可能存在鉤狀效應(yīng)：當(dāng)抗原濃度過高時，可能會出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，導(dǎo)致檢測信號降低，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

  競爭法ELISA

  首先將特異性抗體吸附于固相載體表面，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測抗原的混合液；而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測定的未知抗原的量。這種方法所測定的抗原只要有一個結(jié)合部位即可。

•   包被捕獲抗體：將特異性抗體（捕獲抗體）固定在固相載體表面。

•   分組：將酶標(biāo)板分成兩組，一組加入待測樣品和酶標(biāo)抗原的混合物，另一組只加入酶標(biāo)抗原。

•   競爭結(jié)合：待測樣品中的抗原和酶標(biāo)抗原會競爭結(jié)合固相載體上的捕獲抗體。

•   孵育、洗滌、顯色：經(jīng)過孵育、洗滌、顯色等步驟后，兩組都會產(chǎn)生顏色反應(yīng)。

•   結(jié)果分析：待測樣品中抗原濃度越高，與酶標(biāo)抗原競爭結(jié)合捕獲抗體的能力越強(qiáng)，導(dǎo)致結(jié)合到固相載體上的酶標(biāo)抗原越少，最終顯色信號越弱。通過比較兩組的顯色信號差異，可以間接反映待測樣品中抗原的濃度。

  競爭法ELISA的優(yōu)點是：

•   可以檢測小分子抗原：適用于檢測只有一個表位的抗原，例如激素、藥物等。

•   對樣品純度要求低：樣品中的雜質(zhì)對檢測結(jié)果的影響較小。

  競爭法ELISA的缺點是：

•   靈敏度較低：與夾心法ELISA相比，競爭法ELISA的靈敏度較低。

•   操作步驟相對復(fù)雜：需要設(shè)置對照組，并進(jìn)行信號差異的比較。

  ELISA樣本及應(yīng)用

  ELISA可檢測和計數(shù)體液樣本中的某些抗體、抗原、蛋白質(zhì)和激素。這包括血液、血漿、尿液、唾液（唾液）和腦脊液（CSF）。

  ELISA是免疫測定的黃金標(biāo)準(zhǔn)。使用ELISA的測試可以幫助診斷多種疾病，從細(xì)菌和病毒感染（如萊姆病和HIV）到內(nèi)分泌疾?。ㄈ缂谞钕偌膊。?。

  家庭妊娠測試甚至基于ELISA技術(shù)。他們檢測到一種叫做人絨毛膜促性腺激素（HCG）的激素——“懷孕激素”。

  ELISA廣泛用于食品行業(yè)，用于檢測法律要求的成分標(biāo)簽中是否存在過敏原。該應(yīng)用極大地受益于ELISA的靈敏度，并且可以檢測濃度低至百萬分之幾(ppm)的潛在食品過敏原污染物的水平。它還具有能夠檢測油和其他物質(zhì)（如蛋清或牛奶）的優(yōu)點，而PCR等無法檢測到這些物質(zhì)。

  使用ELISA試劑盒時的注意事項

  該試劑盒僅適用于研究目的，不適用于診斷或治療用途。

  ELISA試劑盒過期后必須停止使用。

  盡量不要將不同批次的試劑混入試劑盒中。

  該試劑盒的制作和測試用于檢測特定樣品以及手冊中存在的目標(biāo)。最終用戶必須非常小心地將其進(jìn)一步用于任何其他目的。

  ELISA試劑盒的安全說明

  ELISA試劑盒提供的終止液通常是酸性溶液。確保正確安全地使用試劑，以避免任何風(fēng)險。

  您必須處理并丟棄所有生物材料，因為它們是潛在有害的材料。因此，請務(wù)必遵守當(dāng)?shù)氐囊?guī)則和法規(guī)。

  手套、實驗服、護(hù)目鏡和外科口罩等個人安全設(shè)備是這些實驗的必需品。吸入任何這些物質(zhì)都會產(chǎn)生副作用。

  使任何ELISA檢測成功的技巧

  任何ELISA檢測都不可能在一夜之間取得成功。最終的努力可以實現(xiàn)這一目標(biāo)。下面給出了一些成功ELISA檢測的有用技巧。

  一致性是關(guān)鍵

  雖然一致性似乎是一個顯而易見的目標(biāo)，但有一些假設(shè)可能會影響其在板之間的存在。應(yīng)該避免混合ELISA試劑盒中的不同成分，因為它們可能會導(dǎo)致潛在的損害。

  確保測定的準(zhǔn)確性

  您可以通過確保檢測中的每個點都有重復(fù)項來努力提高其準(zhǔn)確性。這可能包括從背景到樣品孔的任何內(nèi)容。最重要的是，它可以讓您立即識別任何異常值。

  防止污染

  ELISA測定成功的關(guān)鍵是樣品的變異系數(shù)較低。確保它們都沒有超過理想的百分比，因為它可能導(dǎo)致進(jìn)一步的污染。

  好了，上述為大家介紹了酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）原理和步驟。在ELISA實驗中大家嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行實驗，上文為大家介紹基本原理和步驟，也希望大家在實驗過程善于總結(jié)。也祝大家實驗順利。