elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確？掌握這3大因素讓實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠！

  酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，英文縮寫elisakit，中文也叫ELISA試劑盒或ELISA檢測試劑盒。是酶聯(lián)免疫分析中常用的方法。ELISA基本原理是抗原（或抗體）與固相載體表面結(jié)合并保持其免疫活性?？乖ɑ蚩贵w）與酶連接成為酶標(biāo)抗原（或抗體），酶標(biāo)抗原（或抗體）既保留了其免疫活性又保留了其酶活性。

  ELISA實(shí)驗(yàn)中，待測標(biāo)本（抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原（或抗體）在不同的步驟中與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)。將在固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物通過洗滌的方法與其他物質(zhì)分離，最后與固相載體結(jié)合的酶的量與標(biāo)本中待檢測的抗體或抗原的量成正比。然后加入酶反應(yīng)底物，底物在酶的催化下變成有色產(chǎn)物，根據(jù)顯色反應(yīng)的深度進(jìn)行定性或定量分析，了解待測樣品中抗體或抗原的含量。

  

  ELISA在科研中應(yīng)用比較廣泛。但ELISA實(shí)驗(yàn)操作也一定的技術(shù)要求，通常在ELISA實(shí)驗(yàn)中會遇到一些問題，比如錯誤結(jié)果（既假陽性或陰性的結(jié)果）。這些錯誤結(jié)果往往會影響科研進(jìn)展。了解影響ELISA結(jié)果因素非常有必要，下面通蔚生物為大家總結(jié)錯誤結(jié)果常見的三大因素：

  1、樣本因素

  2、試劑因素

  3、操作因素

  一、樣本因素

  可用于ELISA檢測的標(biāo)本廣泛：體液（如血清、血漿、腦脊液）、分泌物（唾液）、排泄物（如尿液、糞便）均可作為標(biāo)本測定抗體或抗原成分。有些標(biāo)本可以直接測量（如血清、尿液），而另一些則需要預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。

  血清是ELISA檢測中最常用的樣本。血漿通常被視為與血清相同的樣本。標(biāo)本引起的假陽性、假陰性結(jié)果主要是由干擾物質(zhì)引起的，干擾物質(zhì)分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)：

  內(nèi)源性物質(zhì)

  有研究提示，約40%的人血清樣本中含有非特異性干擾物質(zhì)，會不同程度地影響檢測結(jié)果。

  常見干擾物質(zhì)：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗小鼠Ig(s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)等。

  1、類風(fēng)濕因子

  人血清中的IgM和IgG型類風(fēng)濕因子（RF）可以直接與ELISA系統(tǒng)中的FC片段結(jié)合，FC片段可以捕獲抗體和酶標(biāo)二抗導(dǎo)致假陽性。

  2、補(bǔ)體

  在ELISA系統(tǒng)中固體一抗和標(biāo)記二抗的過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)。C1q分子，是抗體分子FC片段的互補(bǔ)體，其結(jié)合位點(diǎn)是暴露的。C1q可以將兩者結(jié)合起來，導(dǎo)致誤報(bào)。

  3、異嗜性抗體

  人血清含有與嚙齒類動物（例如鼠類等）Ig結(jié)合的天然異嗜性抗體，可以在ELISA系統(tǒng)中連接一抗和二抗，也可能導(dǎo)致假陽性。

  4、針對目標(biāo)抗原的自身抗體

  靶抗原的自身抗體，例如抗甲狀腺球蛋白和抗胰島素，有時(shí)會與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，從而干擾ELISA方法中的抗原抗體測定結(jié)果。

  5、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗小鼠Ig(s)抗體

  鼠源CD3等單克隆抗體的臨床應(yīng)用、放射性同位素標(biāo)記的鼠源抗體影像診斷、靶向治療等新技術(shù)可能會導(dǎo)致這些患者體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體。此外，被大鼠等嚙齒類動物咬傷的患者體內(nèi)也可產(chǎn)生抗小鼠Ig(s)抗體。這些患者在進(jìn)行ELISA檢測時(shí)可能會產(chǎn)生假陽性。

  6、交叉反應(yīng)物質(zhì)

  地高辛類、AFP類物質(zhì)等可與靶抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)用多克隆抗體測定抗原時(shí)，測定結(jié)果不會受到太大影響。然而，當(dāng)用單克隆抗體測定抗原時(shí)，如果交叉抗原決定簇恰好是所用單克隆抗體對應(yīng)的目標(biāo)決定簇，則可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

  7、其他物質(zhì)

  血脂、膽紅素、血紅蛋白過高、血液粘度過高等都會對ELISA結(jié)果產(chǎn)生干擾作用。

  外源性物質(zhì)

  外源性物質(zhì)的影響常常是由于用于ELISA測定的血樣采集和保存不當(dāng)造成的。如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本保存時(shí)間過長、標(biāo)本凝集不完全、采血管內(nèi)添加物的影響等。

  1、標(biāo)本溶血

  各種人為因素引起的標(biāo)本溶血，紅細(xì)胞被破壞時(shí)，可釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白。在辣根過氧化物酶標(biāo)記的ELISA測定中，會導(dǎo)致非特異性顯色，從而干擾測定結(jié)果。為了克服上述干擾效應(yīng)，采集標(biāo)本時(shí)必須避免溶血。

  2、標(biāo)本被細(xì)菌污染

  由于細(xì)菌可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，被細(xì)菌污染的標(biāo)本與溶血標(biāo)本一樣，也會產(chǎn)生非特異性顯色，干擾測量結(jié)果。

  3、標(biāo)本保存不當(dāng)

  冰箱保存時(shí)間較長的標(biāo)本，血清中的IgG可聚合成多聚體，AFP可形成二聚體，導(dǎo)致ELISA背景過高，甚至間接ELISA出現(xiàn)假陽性。標(biāo)本放置時(shí)間過長（超過1天），有時(shí)抗原或抗體的免疫反應(yīng)性減弱，可能出現(xiàn)假陰性。

  為了克服上述干擾，ELISA測定的血清樣品應(yīng)新鮮采集。如不立即測定，5天內(nèi)測定的血清樣本可在2-8℃保存，-20℃不超過1個(gè)月，-80℃不超過2個(gè)月。標(biāo)本凍存后溶解，蛋白質(zhì)部分濃縮且分布不均勻。測定前應(yīng)將蛋白質(zhì)充分混合。但混合時(shí)應(yīng)輕柔，不宜劇烈振蕩。

  4、標(biāo)本凝集不完全

  在沒有促凝劑和抗凝劑的情況下，正常血液在采集后0.5至2小時(shí)開始凝固，并在18至24小時(shí)完全凝固。如果在血液未完全凝固時(shí)離心血清，部分纖維蛋白原殘留在血清中，ELISA測定時(shí)會形成肉眼可見的纖維蛋白塊，容易造成假陽性結(jié)果。因此，血樣采集后，必須充分凝固后分離血清，或者用采血管采集標(biāo)本，并在采血管中加入分離膠或合適的凝固劑。

  5、樣品管內(nèi)添加物質(zhì)的影響

  抗凝劑（如肝素）、酶抑制劑（如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性）、快速血清分離膠等均可干擾ELISA測定。

  綜合上述，如果大家在ELISA實(shí)驗(yàn)過程出現(xiàn)假陽性或者假陰性結(jié)果，大家可以先從標(biāo)本因素來去分析，采取相應(yīng)的措施消除干擾，從而獲得正確、可靠的結(jié)果。

  試劑因素

  目前，市場上的elisa試劑盒良莠不齊，質(zhì)量不高的試劑盒質(zhì)量將會對影響elisa檢測的準(zhǔn)確性。因此，選擇合適的試劑盒是非常重要的！

  ELISA試劑盒的用途，如檢測范圍、檢測樣本、應(yīng)用種類等；試劑盒的質(zhì)量控制，例如特異性、敏感性和重現(xiàn)性；客戶對試劑盒套件的驗(yàn)證，例如文獻(xiàn)參考，以及套件的有效期，是我們需要考慮的主要因素。

  1、檢測范圍

  試劑盒的檢測范圍為標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍。特別注意待測樣品的濃度是否落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。對于濃度較高的樣品，可以先進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)，找到良好的稀釋倍數(shù)，然后進(jìn)行大量測量。在此之前，我們可以將ELISA試劑盒中給出的樣本值與NCBI文獻(xiàn)中給出的蛋白表達(dá)參考值uniprot或pax-dab進(jìn)行比較。

  2、應(yīng)用種類

  一般來說，不同物種的ELISA試劑盒不通用，除非試劑盒中有特別說明。

  3、測試樣品

  對于ELISA試劑盒，常見的待測樣品類型有：血清和血漿（不同的抗凝劑）、細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解物。ELISA試劑盒說明書中詳細(xì)說明了待測樣品的類型和稀釋液，請注意不同樣品的稀釋液不要混合。

  4、特異性

  ELISA試劑盒的特異性與試劑盒的關(guān)鍵成分——抗體（對）有關(guān)。該試劑盒用于篩選靶向抗體材料，經(jīng)過嚴(yán)格控制，保證了試劑盒的特異性。

  5、靈敏度

  ELISA靈敏度反映了試劑盒檢測最小量待測物質(zhì)的能力。您可以根據(jù)樣品中待測指標(biāo)的多少來選擇合適的試劑盒。如果待測指標(biāo)量很低，一般試劑盒無法滿足要求，可以選擇高靈敏度ELISA試劑盒。

  6、重復(fù)性

  科學(xué)實(shí)驗(yàn)注重可重復(fù)性。對于一般ELISA試劑盒，板內(nèi)和板間變異系數(shù)應(yīng)控制在15%以內(nèi)。在CUSABIOELISA試劑盒中，大多數(shù)板內(nèi)變異系數(shù)小于8%，板間變異系數(shù)小于10%。

  7、文獻(xiàn)引用

  產(chǎn)品文獻(xiàn)引用，尤其是高質(zhì)量SCI文章的引用，是很多客戶關(guān)心的問題。這是產(chǎn)品識別的一個(gè)非常重要的指標(biāo)，對于相關(guān)用戶的研究具有一定的參考作用。CUSABIOELISA試劑盒的客戶參考文獻(xiàn)已達(dá)4500余篇，并且每年以數(shù)百種的速度增長。

  8、有效期

  一般情況下，試劑盒的有效期為半年，在制備樣品時(shí)需要考慮試劑盒的有效期。

  操作因素

  ELISA技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，在生物學(xué)研究中得到廣泛認(rèn)可，在臨床檢測中也得到廣泛應(yīng)用。對于初學(xué)者來說，如果在實(shí)驗(yàn)操作過程中不注意ELISA的所有步驟，可能會對最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生比較大的影響，如板白、顯色弱、靈敏度低、花板現(xiàn)象、無梯度和高ELISA背景。

  綜上所述，在ELISA實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格遵循ELISA操作規(guī)程，并注意以下問題：

  A.試劑保存：蛋白抗體試劑短期不用時(shí)可保存在-20℃，顯色底物溶液的洗滌液保存在2-8℃。

  b.終止反應(yīng)時(shí)盡量避免微孔中出現(xiàn)氣泡。

  C.酶標(biāo)儀讀數(shù)應(yīng)在反應(yīng)終止后5分鐘內(nèi)完成。

  提前準(zhǔn)備試劑

  A.預(yù)涂酶標(biāo)板和各試劑組分需要在室溫下平衡30分鐘以上。

  b.試劑使用前應(yīng)充分混勻，以保證試劑的均勻性和準(zhǔn)確性。

  C.普通洗滌液是濃縮液，需要提前稀釋，pH值應(yīng)保持在7.2～7.4之間。

  d.一般檢測抗體和酶標(biāo)二抗需要用相應(yīng)的稀釋度稀釋至工作濃度。

  e.不同批次的試劑不能混合，并應(yīng)檢查各組分的有效性。

  添加測試樣本

  A.如果檢測樣品過多，建議分批操作。

  b.需要稀釋的樣品應(yīng)提前稀釋。請參閱使用說明書選擇合適的稀釋劑。

  C.控制上樣時(shí)間，避免上樣時(shí)間過長造成誤差。

  d.注意加樣角度。垂直添加到板底部，不要接觸ELISA板壁。

  e.一份樣品，一個(gè)移液器吸頭。防止交叉污染。

  孵育和洗滌

  A.孵育時(shí)間和溫度按照試劑盒中的說明進(jìn)行。

  b.在水浴或濕盒中孵育以避免“邊緣效應(yīng)”。

  C.注意洗滌次數(shù)、洗滌液的用量、洗滌液浸泡的時(shí)間長短、洗滌的強(qiáng)度。

  d.手洗ELISA板時(shí)，請將板垂直，避免交叉污染；力不能太強(qiáng)以防止抗原-抗體復(fù)合物脫離。

  e.用洗板機(jī)洗板時(shí)，要經(jīng)常檢查沖洗頭是否暢通。

  顯色

  顯色反應(yīng)需要避光，在37℃或室溫下反應(yīng)15至30分鐘。

  讀取與數(shù)據(jù)分析

  終止反應(yīng)時(shí)盡量避免微孔中出現(xiàn)氣泡。

  酶標(biāo)儀讀數(shù)應(yīng)在反應(yīng)終止后5分鐘內(nèi)完成。

  酶標(biāo)儀應(yīng)提前預(yù)熱15至30分鐘。

  數(shù)據(jù)分析一般采用四參數(shù)、直線擬合法進(jìn)行；標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）可用于確定選擇哪種擬合方法。R2一般需要大于0.99，可以點(diǎn)擊這里查看ELISA數(shù)據(jù)分析方法。

  試劑保存

  A.短期不用的蛋白質(zhì)和抗體試劑保存在-20℃。

  b.顯色液和洗滌液儲存于2-8℃。

  上述為大家介紹影響酶聯(lián)免疫試劑盒的結(jié)果的因素，當(dāng)ELISA結(jié)果不理想的時(shí)候，綜合上述3種因素考慮，從而提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。如果您還有疑問，可以和我們在線ELISA顧問尋求幫助！如果考慮ELISA試劑盒，上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司擁有15年以上的ELISA試劑盒生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，搭建了ELISA試劑盒開發(fā)和成熟抗原-抗體系統(tǒng)的良好平臺。可提供4000多種ELISA試劑盒，主要采用夾心法和競爭法，覆蓋3000個(gè)靶標(biāo)，涉及小鼠、大鼠、牛、兔、豬等20多個(gè)種類。