發(fā)布時(shí)間:2024-04-19 發(fā)布作者:通蔚生物
酶聯(lián)免疫吸附試劑盒,英文縮寫elisakit,中文也叫ELISA試劑盒或ELISA檢測試劑盒。是酶聯(lián)免疫分析中常用的方法。ELISA基本原理是抗原(或抗體)與固相載體表面結(jié)合并保持其免疫活性??乖ɑ蚩贵w)與酶連接成為酶標(biāo)抗原(或抗體),酶標(biāo)抗原(或抗體)既保留了其免疫活性又保留了其酶活性。
ELISA實(shí)驗(yàn)中,待測標(biāo)本(抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原(或抗體)在不同的步驟中與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)。將在固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物通過洗滌的方法與其他物質(zhì)分離,最后與固相載體結(jié)合的酶的量與標(biāo)本中待檢測的抗體或抗原的量成正比。然后加入酶反應(yīng)底物,底物在酶的催化下變成有色產(chǎn)物,根據(jù)顯色反應(yīng)的深度進(jìn)行定性或定量分析,了解待測樣品中抗體或抗原的含量。
ELISA在科研中應(yīng)用比較廣泛。但ELISA實(shí)驗(yàn)操作也一定的技術(shù)要求,通常在ELISA實(shí)驗(yàn)中會(huì)遇到一些問題,比如錯(cuò)誤結(jié)果(既假陽性或陰性的結(jié)果)。這些錯(cuò)誤結(jié)果往往會(huì)影響科研進(jìn)展。了解影響ELISA結(jié)果因素非常有必要,下面通蔚生物為大家總結(jié)錯(cuò)誤結(jié)果常見的三大因素:
1、樣本因素
2、試劑因素
3、操作因素
一、樣本因素
可用于ELISA檢測的標(biāo)本廣泛:體液(如血清、血漿、腦脊液)、分泌物(唾液)、排泄物(如尿液、糞便)均可作為標(biāo)本測定抗體或抗原成分。有些標(biāo)本可以直接測量(如血清、尿液),而另一些則需要預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)。
血清是ELISA檢測中最常用的樣本。血漿通常被視為與血清相同的樣本。標(biāo)本引起的假陽性、假陰性結(jié)果主要是由干擾物質(zhì)引起的,干擾物質(zhì)分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì):
內(nèi)源性物質(zhì)
有研究提示,約40%的人血清樣本中含有非特異性干擾物質(zhì),會(huì)不同程度地影響檢測結(jié)果。
常見干擾物質(zhì):類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗小鼠Ig(s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)等。
1、類風(fēng)濕因子
人血清中的IgM和IgG型類風(fēng)濕因子(RF)可以直接與ELISA系統(tǒng)中的FC片段結(jié)合,FC片段可以捕獲抗體和酶標(biāo)二抗導(dǎo)致假陽性。
2、補(bǔ)體
在ELISA系統(tǒng)中固體一抗和標(biāo)記二抗的過程中,抗體分子發(fā)生變構(gòu)。C1q分子,是抗體分子FC片段的互補(bǔ)體,其結(jié)合位點(diǎn)是暴露的。C1q可以將兩者結(jié)合起來,導(dǎo)致誤報(bào)。
3、異嗜性抗體
人血清含有與嚙齒類動(dòng)物(例如鼠類等)Ig結(jié)合的天然異嗜性抗體,可以在ELISA系統(tǒng)中連接一抗和二抗,也可能導(dǎo)致假陽性。
4、針對目標(biāo)抗原的自身抗體
靶抗原的自身抗體,例如抗甲狀腺球蛋白和抗胰島素,有時(shí)會(huì)與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物,從而干擾ELISA方法中的抗原抗體測定結(jié)果。
5、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗小鼠Ig(s)抗體
鼠源CD3等單克隆抗體的臨床應(yīng)用、放射性同位素標(biāo)記的鼠源抗體影像診斷、靶向治療等新技術(shù)可能會(huì)導(dǎo)致這些患者體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體。此外,被大鼠等嚙齒類動(dòng)物咬傷的患者體內(nèi)也可產(chǎn)生抗小鼠Ig(s)抗體。這些患者在進(jìn)行ELISA檢測時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生假陽性。
6、交叉反應(yīng)物質(zhì)
地高辛類、AFP類物質(zhì)等可與靶抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)用多克隆抗體測定抗原時(shí),測定結(jié)果不會(huì)受到太大影響。然而,當(dāng)用單克隆抗體測定抗原時(shí),如果交叉抗原決定簇恰好是所用單克隆抗體對應(yīng)的目標(biāo)決定簇,則可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
7、其他物質(zhì)
血脂、膽紅素、血紅蛋白過高、血液粘度過高等都會(huì)對ELISA結(jié)果產(chǎn)生干擾作用。
外源性物質(zhì)
外源性物質(zhì)的影響常常是由于用于ELISA測定的血樣采集和保存不當(dāng)造成的。如標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本保存時(shí)間過長、標(biāo)本凝集不完全、采血管內(nèi)添加物的影響等。
1、標(biāo)本溶血
各種人為因素引起的標(biāo)本溶血,紅細(xì)胞被破壞時(shí),可釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白。在辣根過氧化物酶標(biāo)記的ELISA測定中,會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色,從而干擾測定結(jié)果。為了克服上述干擾效應(yīng),采集標(biāo)本時(shí)必須避免溶血。
2、標(biāo)本被細(xì)菌污染
由于細(xì)菌可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶,被細(xì)菌污染的標(biāo)本與溶血標(biāo)本一樣,也會(huì)產(chǎn)生非特異性顯色,干擾測量結(jié)果。
3、標(biāo)本保存不當(dāng)
冰箱保存時(shí)間較長的標(biāo)本,血清中的IgG可聚合成多聚體,AFP可形成二聚體,導(dǎo)致ELISA背景過高,甚至間接ELISA出現(xiàn)假陽性。標(biāo)本放置時(shí)間過長(超過1天),有時(shí)抗原或抗體的免疫反應(yīng)性減弱,可能出現(xiàn)假陰性。
為了克服上述干擾,ELISA測定的血清樣品應(yīng)新鮮采集。如不立即測定,5天內(nèi)測定的血清樣本可在2-8℃保存,-20℃不超過1個(gè)月,-80℃不超過2個(gè)月。標(biāo)本凍存后溶解,蛋白質(zhì)部分濃縮且分布不均勻。測定前應(yīng)將蛋白質(zhì)充分混合。但混合時(shí)應(yīng)輕柔,不宜劇烈振蕩。
4、標(biāo)本凝集不完全
在沒有促凝劑和抗凝劑的情況下,正常血液在采集后0.5至2小時(shí)開始凝固,并在18至24小時(shí)完全凝固。如果在血液未完全凝固時(shí)離心血清,部分纖維蛋白原殘留在血清中,ELISA測定時(shí)會(huì)形成肉眼可見的纖維蛋白塊,容易造成假陽性結(jié)果。因此,血樣采集后,必須充分凝固后分離血清,或者用采血管采集標(biāo)本,并在采血管中加入分離膠或合適的凝固劑。
5、樣品管內(nèi)添加物質(zhì)的影響
抗凝劑(如肝素)、酶抑制劑(如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性)、快速血清分離膠等均可干擾ELISA測定。
綜合上述,如果大家在ELISA實(shí)驗(yàn)過程出現(xiàn)假陽性或者假陰性結(jié)果,大家可以先從標(biāo)本因素來去分析,采取相應(yīng)的措施消除干擾,從而獲得正確、可靠的結(jié)果。
目前,市場上的elisa試劑盒良莠不齊,質(zhì)量不高的試劑盒質(zhì)量將會(huì)對影響elisa檢測的準(zhǔn)確性。因此,選擇合適的試劑盒是非常重要的!
ELISA試劑盒的用途,如檢測范圍、檢測樣本、應(yīng)用種類等;試劑盒的質(zhì)量控制,例如特異性、敏感性和重現(xiàn)性;客戶對試劑盒套件的驗(yàn)證,例如文獻(xiàn)參考,以及套件的有效期,是我們需要考慮的主要因素。
1、檢測范圍
試劑盒的檢測范圍為標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍。特別注意待測樣品的濃度是否落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。對于濃度較高的樣品,可以先進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn),找到良好的稀釋倍數(shù),然后進(jìn)行大量測量。在此之前,我們可以將ELISA試劑盒中給出的樣本值與NCBI文獻(xiàn)中給出的蛋白表達(dá)參考值uniprot或pax-dab進(jìn)行比較。
2、應(yīng)用種類
一般來說,不同物種的ELISA試劑盒不通用,除非試劑盒中有特別說明。
3、測試樣品
對于ELISA試劑盒,常見的待測樣品類型有:血清和血漿(不同的抗凝劑)、細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解物。ELISA試劑盒說明書中詳細(xì)說明了待測樣品的類型和稀釋液,請注意不同樣品的稀釋液不要混合。
4、特異性
ELISA試劑盒的特異性與試劑盒的關(guān)鍵成分——抗體(對)有關(guān)。該試劑盒用于篩選靶向抗體材料,經(jīng)過嚴(yán)格控制,保證了試劑盒的特異性。
5、靈敏度
ELISA靈敏度反映了試劑盒檢測最小量待測物質(zhì)的能力。您可以根據(jù)樣品中待測指標(biāo)的多少來選擇合適的試劑盒。如果待測指標(biāo)量很低,一般試劑盒無法滿足要求,可以選擇高靈敏度ELISA試劑盒。
6、重復(fù)性
科學(xué)實(shí)驗(yàn)注重可重復(fù)性。對于一般ELISA試劑盒,板內(nèi)和板間變異系數(shù)應(yīng)控制在15%以內(nèi)。在CUSABIOELISA試劑盒中,大多數(shù)板內(nèi)變異系數(shù)小于8%,板間變異系數(shù)小于10%。
7、文獻(xiàn)引用
產(chǎn)品文獻(xiàn)引用,尤其是高質(zhì)量SCI文章的引用,是很多客戶關(guān)心的問題。這是產(chǎn)品識(shí)別的一個(gè)非常重要的指標(biāo),對于相關(guān)用戶的研究具有一定的參考作用。CUSABIOELISA試劑盒的客戶參考文獻(xiàn)已達(dá)4500余篇,并且每年以數(shù)百種的速度增長。
8、有效期
一般情況下,試劑盒的有效期為半年,在制備樣品時(shí)需要考慮試劑盒的有效期。
ELISA技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性,在生物學(xué)研究中得到廣泛認(rèn)可,在臨床檢測中也得到廣泛應(yīng)用。對于初學(xué)者來說,如果在實(shí)驗(yàn)操作過程中不注意ELISA的所有步驟,可能會(huì)對最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生比較大的影響,如板白、顯色弱、靈敏度低、花板現(xiàn)象、無梯度和高ELISA背景。
綜上所述,在ELISA實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格遵循ELISA操作規(guī)程,并注意以下問題:
A.試劑保存:蛋白抗體試劑短期不用時(shí)可保存在-20℃,顯色底物溶液的洗滌液保存在2-8℃。
b.終止反應(yīng)時(shí)盡量避免微孔中出現(xiàn)氣泡。
C.酶標(biāo)儀讀數(shù)應(yīng)在反應(yīng)終止后5分鐘內(nèi)完成。
提前準(zhǔn)備試劑
A.預(yù)涂酶標(biāo)板和各試劑組分需要在室溫下平衡30分鐘以上。
b.試劑使用前應(yīng)充分混勻,以保證試劑的均勻性和準(zhǔn)確性。
C.普通洗滌液是濃縮液,需要提前稀釋,pH值應(yīng)保持在7.2~7.4之間。
d.一般檢測抗體和酶標(biāo)二抗需要用相應(yīng)的稀釋度稀釋至工作濃度。
e.不同批次的試劑不能混合,并應(yīng)檢查各組分的有效性。
添加測試樣本
A.如果檢測樣品過多,建議分批操作。
b.需要稀釋的樣品應(yīng)提前稀釋。請參閱使用說明書選擇合適的稀釋劑。
C.控制上樣時(shí)間,避免上樣時(shí)間過長造成誤差。
d.注意加樣角度。垂直添加到板底部,不要接觸ELISA板壁。
e.一份樣品,一個(gè)移液器吸頭。防止交叉污染。
孵育和洗滌
A.孵育時(shí)間和溫度按照試劑盒中的說明進(jìn)行。
b.在水浴或濕盒中孵育以避免“邊緣效應(yīng)”。
C.注意洗滌次數(shù)、洗滌液的用量、洗滌液浸泡的時(shí)間長短、洗滌的強(qiáng)度。
d.手洗ELISA板時(shí),請將板垂直,避免交叉污染;力不能太強(qiáng)以防止抗原-抗體復(fù)合物脫離。
e.用洗板機(jī)洗板時(shí),要經(jīng)常檢查沖洗頭是否暢通。
顯色
顯色反應(yīng)需要避光,在37℃或室溫下反應(yīng)15至30分鐘。
讀取與數(shù)據(jù)分析
終止反應(yīng)時(shí)盡量避免微孔中出現(xiàn)氣泡。
酶標(biāo)儀讀數(shù)應(yīng)在反應(yīng)終止后5分鐘內(nèi)完成。
酶標(biāo)儀應(yīng)提前預(yù)熱15至30分鐘。
數(shù)據(jù)分析一般采用四參數(shù)、直線擬合法進(jìn)行;標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)可用于確定選擇哪種擬合方法。R2一般需要大于0.99,可以點(diǎn)擊這里查看ELISA數(shù)據(jù)分析方法。
試劑保存
A.短期不用的蛋白質(zhì)和抗體試劑保存在-20℃。
b.顯色液和洗滌液儲(chǔ)存于2-8℃。
上述為大家介紹影響酶聯(lián)免疫試劑盒的結(jié)果的因素,當(dāng)ELISA結(jié)果不理想的時(shí)候,綜合上述3種因素考慮,從而提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。如果您還有疑問,可以和我們在線ELISA顧問尋求幫助!如果考慮ELISA試劑盒,上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司擁有15年以上的ELISA試劑盒生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn),搭建了ELISA試劑盒開發(fā)和成熟抗原-抗體系統(tǒng)的良好平臺(tái)??商峁?/span>4000多種ELISA試劑盒,主要采用夾心法和競爭法,覆蓋3000個(gè)靶標(biāo),涉及小鼠、大鼠、牛、兔、豬等20多個(gè)種類。